陽春砂多糖的分離純化及體外抗氧化作用研究

李世杰，張丹雁，嚴婭娟，曹 曼

廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006

陽春砂來源于姜科豆蔻屬植物陽春砂(Amomum villosum Lour.)的干燥成熟果實，是我國著名的“四大南藥”之一。具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效，臨床上主要用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動不安等癥［1］。

近年來，大量學者從植物、微生物中提取多糖并進行相關藥理研究，取得了巨大的成果。目前研究表明，多糖具有抗炎、抗氧化、抗癌、調節免疫、降低血壓等功效［2-6］。然而，陽春砂多糖(Amomum villosum polysaccharides，以下簡稱AVP)的藥理活性研究還尚未見報導，目前針對陽春砂的藥理研究主要集中在其水提液及揮發油研究上，單純研究水提液的藥理作用不能闡明其具體作用機制，無法給出合理科學的解釋，而陽春砂水提液中主要成分為水溶性多糖，因此，對AVP 初步藥理活性研究具有重要的現實意義。本文以AVP 及其純化組分為研究對象，比較其對超氧陰離子自由基、羥自由基及二苯代苦味肼基自由基的清除作用，以了解AVP 抗氧化作用活性，為陽春砂的開發提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

陽春砂，采自陽春市砂仁種植場，樣品經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定為姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果實;乙醇(AR，上海久億試劑公司)，硫酸(AR，上海久億試劑公司)，正丁醇(AR，南京試劑公司)，氯仿(AR，南京試劑公司);DEAE-纖維素-52 凝膠、SephadexG-100 凝膠、葡聚糖標準品、1，1-二苯基苦基苯肼、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、吩嗦硫酸甲酯(PMS)、還原型輔酶I(NADH)、三吡啶吖嗪(TPTZ)購于Sigma 公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

KQ-400KDE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA2004 電子天平(上海恒平科學儀器有限公司);501-A 型超級恒溫器(上海實驗儀器廠有限公司);DL-6000B 離心機(上海安亭科學儀器廠);UV-360 紫外可見分光光度計(日本島津公司);DHL-2B 型電腦數顯恒流泵、DBS-100A 型電腦全自動部份收集器(上海滬西分析儀器廠);層析柱(2.6 ×30 cm，2.6 ×60 cm，上海亞榮生化儀器有限公司);Alphal-2 型冷凍干燥機(英國LABCONCO 公司);Re-52AA 型旋轉蒸發儀(金壇市玻璃實驗廠)。后得到三個主要組分，分別為純水洗脫的組分Fl、0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫的組分F2和0.3 mol/L NaCl 溶液洗脫的組分F3。

圖1 AVP DEAE-纖維素-52 色譜柱洗脫曲線圖Fig.1 DEAE-cellulose-52 column elution curve of AVP

2 方法與結果

2.1 AVP 分離純化

2.1.1 AVP 樣品制備

采用水提醇沉法［7］得到粗多糖AVP 樣品。

2.1.2 離子交換色譜法初步分離

稱取60 mg AVP 粗多糖溶于3 mL 去離子水中，加樣于DEAE-纖維素-52 層析柱(2.6 ×30 cm)中，用0.0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液依次梯度洗脫，流速1.0 mL/min，分步收集(10 min/管)，每梯度20 管，硫酸-苯酚法檢測各管多糖含量(490 nm處吸收值)，收集不同洗脫梯度相應的組分。合并相同組分，50 ℃旋轉蒸發濃縮，去離子水透析48 h以去除NaCl 及小分子雜質，最后將透析液真空冷凍干燥，得初步純化產品。同時以收集的管數為橫坐標、吸光值(490 nm)為縱坐標繪制DEAE-纖維素-52 色譜柱洗脫曲線，洗脫曲線見圖1。由圖1 可以看出，陽春砂多糖經DEAE-纖維素-52 層析柱分離

2.1.3 葡聚糖凝膠色譜法進一步純化

分別稱取10 mg 經DEAE-纖維素-52 初步純化的各多糖組分，溶于5 mL 去離子水中，加樣于Sephadex G-l00 層析柱(2.6 ×60 cm)中，用去離子水洗脫，流速0.25 mL/min，分步收集(10 min/管)。硫酸-苯酚法檢測各管多糖含量(490 nm 處吸收值)，分別收集不同的組分。合并相同組分，50 ℃減壓蒸發濃縮，去離子水透析48 h 以去除小分子雜質，最后將透析液真空冷凍干燥，得純化產品用于進一步的分析。同時以收集的管數為橫坐標、吸光值(490 nm)為縱坐標繪制Sephadex G-100 色譜柱洗脫曲線，洗脫曲線見圖2。從圖2 可以看出，初步分離的三個組分(F1、F2和F3)經葡聚糖G-100 凝膠柱分離后各得一個純化組分，分別命名為AVP-1、AVP-2 和AVP-3。多糖組分由于存在糖醛酸、硫酸基等一些荷電基團，因此要想獲得純多糖，通常先按照離子強度的不同進行初步分離，得到電荷單一的組分，然后再通過分子量的不同進行第二次分離獲得電荷和分子量均單一的多糖。本實驗通過離子交換層析和凝膠過濾層析純化陽春砂多糖，得到了三個純化組分(AVP-1、AVP-2 和AVP-3)，用于進一步的分析。

圖2 AVP Sephadex G-100 色譜柱洗脫曲線圖Fig.2 Sephadex G-100 column elution curves of AVP

2.2 AVP 抗氧化實驗

2.2.1 多糖對超氧陰離子自由基(O-·2)的清除作用

采用超氧陰離子自由基體系［8］，觀察多糖對的清除作用。取不同濃度的AVP 樣品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)1.0 mL 于試管中，分別加入1.0 mL NBT 溶液(156 μmol/L)、1.0 mL NADH 溶液(468 μmol/L)和1.0 mL PMS 溶液(60 μmol/L)。混勻反應體系，25 ℃水浴5 min，于560 nm 波長處測吸光度。NBT 溶液、NADH 溶液及PMS 溶液都是用0.1 M pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液配制。以水代替AVP、維生素C 溶液;0.1 M pH=7.4 磷酸鹽緩沖液代替NBT 溶液，作空白實驗調零用。每個試樣做3次平行試驗取平均值。清除率計算公式為:

式中:A0為對照實驗(水代替AVP、維生素C溶液)的吸光度;A1為樣品實驗的吸光度;A2為樣品干擾實驗(0.1M pH=7.4 磷酸鹽緩沖液代替NBT 溶液)的吸光度。

不同濃度的AVP 對超氧陰離子自由基的清除作用結果見圖3。由圖3 可知，AVP 及其純化組分AVP-1、AVP-2、AVP-3 對自由基清除活性呈一定的量效關系。AVP-3 清除活性稍高于粗AVP、AVP-1 及AVP-2。當濃度高于1 mg/mL 時，多糖清除活性優于陽性對照品維生素C。

圖3 陽春砂多糖及其純化組分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除活性Fig.3 Scavenging effects of AVP and its purified fractions(AVP-1，AVP-2 and AVP-3)on superoxide radical

2.2.2 多糖對羥基自由基(·OH)的清除作用

羥基自由基清除活性的測定參照Yang 等［9］報道的方法稍作修改。取不同濃度的AVP 樣品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)溶液1.0 mL 于試管中，分別加入2.4mL 磷酸鹽緩沖液(0.1M pH=7.4)和0.6 mL H2O2溶液(40 mmol/L)。混勻反應體系，10 min 后于分光光度計230 nm處測吸光度，以水代替AVP、維生素C 溶液和H2O2溶液，作空白實驗調零用。每個試樣做3 次平行試驗取平均值，清除率計算公式同式1。

不同濃度的AVP 對羥基自由基的清除作用結果見圖4。由圖4 可知，AVP 及其純化組分對·OH自由基具有明顯的清除活性。AVP-3 清除·OH 自由基活性最強，當其濃度達到3.0 mg/mL 時，對·OH自由基清除率為68.2%。但是AVP 及其純化組分對·OH 自由基清除活性比陽性對照品要弱。

圖4 陽春砂多糖及其純化組分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除·OH 活性Fig.4 Scavenging effects on hydroxyl radical of AVP and its purified fraction (AVP-1，AVP-2 and AVP-3)

2.2.3 多糖對1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)

DPPH·自由基清除活性的測定參照Li 等［3］報道的方法稍作修改。取不同濃度的AVP 樣品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)1.0 mL 于試管中，分別加入0.2 mL DPPH 溶液(0.4 mmol/L)，再加入2.0 mL 水。混勻反應體系，30 min 后于波長517 nm 處測吸光度。DPPH 溶液用無水乙醇配制。以水代替AVP、維生素C 溶液，無水乙醇代替DPPH溶液，作空白實驗調零用。每個試樣做3 次平行試驗取平均值。清除率計算公式同式1。

圖5 陽春砂多糖及其純化組分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除DPPH·活性Fig.5 Scavenging effects of AVP and its purified fraction(AVP-1，AVP-2 and AVP-3)on DPPH radical

不同濃度的AVP 對DPPH·的清除作用結果見圖5，圖5 表明AVP 及其純化組分對DPPH·都具有一定的清除活性。AVP-1 對DPPH·的清除作用最弱，AVP-3 清除活性最強;當濃度達到5 mg/mL時，AVP-3 對DPPH·的清除作用基本與陽性對照品相同。

3 結論

植物來源的多糖類化合物擁有免疫調節、抗腫瘤活性以及降血糖、降血脂活性和抗氧化等的獨特功能，而且大多數毒性較小，在預防疾病上優于其他化合物，因此其應用具有廣闊的前景。本實驗以陽春砂粗多糖AVP 及純化后的組分AVP-1、AVP-2、AVP-3 為研究對象進行抗氧化活性研究，確證了陽春砂多糖具有抗氧化的作用，它們具有很好的清除超氧陰離子自由基()、羥基自由基(·OH)及1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)活性，AVP-3比粗AVP、AVP-1 及AVP-2 具有更強的體外抗氧化活性。AVP 及其純化組分對超氧陰離子自由基)清除活性要顯著優于維生素C。陽春砂多糖的藥理活性目前尚未有深入研究，本實驗為陽春砂相關藥品及食品研究開發提供的新的研究思路，為陽春砂的開發利用提供一定的理論依據。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，236.

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