阿魏酸及其不同配伍藥代動力學(xué)比較研究

馮彬彬，張建海，徐曉玉

1重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 404120;2 西南大學(xué)，重慶 400716

阿魏酸是一種有機(jī)酸，為當(dāng)歸、川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)等中藥的有效成分之一，具有抑制血小板聚集、血栓形成及抗腫瘤和抗炎等功效。臨床上用于治療血管栓塞性脈管炎、急性腦血栓和偏頭痛、動脈粥樣硬化癥等疾病［1，2］。近年來，有關(guān)阿魏酸鈉鹽的藥動學(xué)研究及藥材配伍中阿魏酸的藥動學(xué)研究較多［3-6］，但阿魏酸單體及其不同單體配伍對阿魏酸在體內(nèi)的吸收、分布與代謝等藥代動力學(xué)研究報(bào)道較少［7，8］。本實(shí)驗(yàn)主要研究川芎嗪、延胡索乙素2個(gè)單體對阿魏酸在雌性大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)的影響，結(jié)合中藥辯證藥動學(xué)的研究，對阿魏酸及其不同配伍藥動學(xué)進(jìn)行比較研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器與藥品

H1650-W 臺式微量高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);EL-204 電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］;Agilent 1200 高效液相色譜(HPLC)儀;智能柱溫箱;MWV 紫外檢測器;WH-2 微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

甲醇為色譜純，購自迪馬公司;冰醋酸為分析純;水為去離子水;阿魏酸對照品，批號:110773-200611，購自中國藥品生物制品檢定院;香豆素對照品，購自Sigma 公司;阿魏酸、川芎嗪(TMP)、延胡索乙素(TET)原料藥，購自南京澤朗有限責(zé)任公司，含量均在98%以上。

1.2 動物

Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，雌性，體重為220 ±20 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:SCXK(渝)2007-0001，動物飼養(yǎng)于SPF 級實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)環(huán)境合格證號:SYXK(渝)2009-0002。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC 條件

色譜柱:Agilent SB-C18ODS(4.6 ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇∶ 0.3% 冰醋酸水溶液(42 ∶58);流速:1.0 mL/min;檢測波長:280 nm;溫度:30℃。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)溶液制備

取阿魏酸對照品50 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得0.5 mg/mL 的對照品儲備液。同樣方法配制香豆素儲備液濃度為0.73 mg/mL。再將阿魏酸儲備液分別稀釋為八個(gè)不同濃度，香豆素儲備液稀釋至濃度為7.3 μg/mL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取大鼠空白血漿8 份各100 μL，分別加入100 μL 不同濃度的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL 相同濃度的內(nèi)標(biāo)，配制成含阿魏酸0.0254、0.2535、0.5071、1.0142、2.0417、4.0833、8.3333、11.1111 μg/mL 系列濃度;渦旋2 min，10000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，取10 μL 進(jìn)樣，以阿魏酸和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比與阿魏酸濃度作回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取大鼠血漿9 份各100 μL，加入低、中、高不同濃度的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，再加相同濃度的內(nèi)標(biāo)100 μL，配成低、中、高不同濃度的樣品，按照2.3 項(xiàng)下的樣品處理方法進(jìn)行處理。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按2.4 項(xiàng)下配制成高、中、低3 種濃度的阿魏酸血漿樣品各3 份，用同一標(biāo)準(zhǔn)曲線測定得精密度。

2.6 血漿樣品制備

將SD 大鼠分為阿魏酸組、阿魏酸+川芎嗪組、阿魏酸+延胡索乙素組、阿魏酸+川芎嗪+延胡索乙素組，每組8 只，受試大鼠禁食不禁水12 h 后，根據(jù)前期工作以及相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)較為理想的結(jié)果［7，8］，分別按50 mg/kg、50 mg/kg +30 mg/kg、50 mg/kg+20 mg/kg 和50 mg/kg +30 mg/kg +20 mg/kg 劑量灌胃給藥，阿魏酸組成分于灌胃后0、2、5、10、20、30、45、60、90、120、180、240 min 眼眶取靜脈血0.5 mL;阿魏酸+川芎嗪組組于灌胃后0、5、10、20、30、45、60、90、150、210、300、480、720 min 眼眶取靜脈血0.5 mL;阿魏酸+延胡索乙素組組于灌胃后0、5、10、20、30、60、90、150、240、480、720、1440、2160 min眼眶取靜脈血0.5 mL;阿魏酸+川芎嗪+延胡索乙素組于灌胃后0、5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、480、720、1440、2610 min 眼眶取靜脈血0.5 mL;所采血液均放入有肝素鈉的EP 管中，10000 rpm 離心5 min;取血漿放-20 ℃冰箱保存，用于阿魏酸血藥濃度的檢測。

圖1 阿魏酸及其不同配伍的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of ferulic acid with different combinations

2.7 血樣處理

精密吸取大鼠血漿樣品100 μL，加100 μL 內(nèi)標(biāo)和100 μL 甲醇，按2.3 項(xiàng)下的處理方法處理。

2.8 數(shù)據(jù)處理

所測數(shù)據(jù)采用DAS2.0 藥代動力學(xué)程序，計(jì)算主要藥動學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法專屬性考察

在本色譜條件下測得的色譜圖見圖1。阿魏酸和內(nèi)標(biāo)(香豆素)得到較好分離，無明顯干擾峰。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

根據(jù)2.2 項(xiàng)下的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以阿魏酸濃度為橫坐標(biāo)，以阿魏酸和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.1276x-0.0032，r=0.9996，表明:阿魏酸在0.0254～11.1111 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 回收率試驗(yàn)

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可以看出川芎嗪組阿魏酸、阿魏酸+川芎嗪組、阿魏酸+延胡索乙素組、阿魏酸+川芎嗪+延胡索乙素組中的阿魏酸平均回收率均在80%～120% 之間，RSD 均小于10%，表明該方法回收率符合要求。

表1 阿魏酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3，)Table 1 Recovery of the developed HPLC method for the quantification of ferulic acid(n=3，)

表1 阿魏酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3，)Table 1 Recovery of the developed HPLC method for the quantification of ferulic acid(n=3，)

3.4 精密度試驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2 可以看出阿魏酸低濃度精密度RSD 均小于20%，中、高濃度精密度RSD 均小于15%，表明精密度良好，符合生物樣品精密度要求。

表2 阿魏酸精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5，)Table 2 The precision of the developed HPLC method for the quantification of ferulic acid(n=5，)

表2 阿魏酸精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5，)Table 2 The precision of the developed HPLC method for the quantification of ferulic acid(n=5，)

3.5 藥代動力學(xué)

以DAS 2.0 藥代動力學(xué)程序進(jìn)行曲線擬合，大鼠灌胃給藥后不同配伍阿魏酸的藥代動力學(xué)參數(shù)見表3，藥-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 不同成分配伍阿魏酸藥-時(shí)間曲線圖Fig.2 The concentration-time curves of ferulic acid with different combinations

阿魏酸不同成分配伍給藥藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)、達(dá)峰時(shí)間Tmax、半衰期t1/2和平均駐留時(shí)間MRT(0-t)都大于阿魏酸單獨(dú)給藥，其中與延胡索乙素配伍和與川芎嗪和延胡索乙素兩者配伍對阿魏酸AUC(0-t)的影響最大，見圖2;阿魏酸與川芎嗪配伍時(shí)，藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)和達(dá)峰濃度Cmax與阿魏酸單獨(dú)給藥相比沒有顯著差異，但平均駐留時(shí)間MRT(0-t)、半衰期t1/2和達(dá)峰時(shí)間Tmax顯著比阿魏酸單獨(dú)給藥時(shí)延長(P＜0.05);阿魏酸與延胡索乙素配伍時(shí)，達(dá)峰時(shí)間Tmax和達(dá)峰濃度Cmax與阿魏酸單獨(dú)給藥相比沒有顯著差異，但藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)顯著高于阿魏酸單獨(dú)給藥(P＜0.05)，平均駐留時(shí)間MRT(0-t)和半衰期t1/2顯著比阿魏酸單獨(dú)給藥時(shí)延長(P＜0.05);阿魏酸與川芎嗪和延胡索乙素同時(shí)配伍時(shí)藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)、達(dá)峰時(shí)間Tmax、達(dá)峰時(shí)間Tmax、半衰期t1/2和平均駐留時(shí)間MRT(0-t)都顯著大于阿魏酸單獨(dú)給藥(P＜0.05)，見表3。

表3 不同成分配伍阿魏酸藥動學(xué)參數(shù)比較Table 3 The pharmacokinetic parameters of ferulic acid with different combinations

4 討論

4.1 測定方法的討論

本試驗(yàn)采用HPLC 測定血漿中阿魏酸的濃度，用有機(jī)溶劑直接沉淀蛋白，所需設(shè)備及樣本制備過程簡單。測定阿魏酸的HPLC 色譜條件，本實(shí)驗(yàn)采用課題組穩(wěn)定的方法［7，8］確定色譜條件為:甲醇∶0.3%冰醋酸水溶液(42∶58)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。該測定方法精密度高，回收率好，阿魏酸和內(nèi)標(biāo)峰型良好，無雜質(zhì)干擾，基線穩(wěn)定，適用于生物樣本的測定。

4.2 藥動學(xué)結(jié)果討論

由表3 可見:阿魏酸不同配伍給藥與單獨(dú)給藥后阿魏酸的藥代動力學(xué)參數(shù)存在差異:阿魏酸與川芎嗪配伍時(shí)其主要藥動學(xué)參數(shù)，藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)和達(dá)峰濃度Cmax與阿魏酸單獨(dú)給藥沒有顯著差異，但達(dá)峰時(shí)間Tmax、半衰期t1/2和平均駐留時(shí)間MRT(0-t)顯著比阿魏酸單獨(dú)給藥時(shí)延長(P＜0.05)，說明川芎嗪可以延長阿魏酸在大鼠體內(nèi)的作用時(shí)間，使其消除減慢，有緩釋的效果;阿魏酸與延胡索乙素配伍時(shí)其主要藥動學(xué)參數(shù)，達(dá)峰時(shí)間Tmax和達(dá)峰濃度Cmax與阿魏酸單獨(dú)給藥相比沒有顯著差異，但藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)顯著高于阿魏酸單獨(dú)給藥(P＜0.05)，平均駐留時(shí)間MRT(0-t)和半衰期t1/2顯著比阿魏酸單獨(dú)給藥時(shí)延長(P＜0.05);說明延胡索乙素能加快并增加阿魏酸在在大鼠體內(nèi)的吸收，并延長阿魏酸在大鼠體內(nèi)的作用時(shí)間;阿魏酸與川芎嗪、延胡索乙素同時(shí)配伍時(shí)其主要藥動學(xué)參數(shù)藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)、達(dá)峰時(shí)間Tmax、達(dá)峰時(shí)間Tmax、半衰期t1/2和平均駐留時(shí)間MRT(0-t)都顯著大于阿魏酸單獨(dú)給藥(P＜0.05)，說明川芎嗪、延胡索乙素能同時(shí)加快并增加阿魏酸在大鼠體內(nèi)的吸收，延長阿魏酸在大鼠體內(nèi)的作用時(shí)間，二者對阿魏酸有協(xié)同增效作用。結(jié)果表明，阿魏酸不同配伍在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)有差異，提示不同組分在藥動學(xué)方面存在相互影響。

1 Zhang Z(張壯)，Yan YF(閆彥芳)，Chen KJ(陳可冀).Study on the pharmacokinetics of ferulic acid in Canine serum after giving an intragastrical single dose of Xiongshao capsules to a dog.J Beijing Univ TCM(北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2001，24(1):25-28.

2 Liu XF(劉曉峰)，Wu XA(武新安)，Wei YH(魏玉輝)，et al.阿魏酸和川芎湯劑中阿魏酸在大鼠體內(nèi)的吸收動力學(xué)研究.J Chin Med Mater(中藥材)，2007，30:831-833.

3 Xu S(徐術(shù))，Hu JH(胡晉紅)，Li FQ(李鳳前).Determination of sodium ferulate in Beagle dog plasma by HPLC and its pharmacokinetics.Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2005，27:1062-1065.

4 Liu XD(劉曉東)，Xue YY(薛玉英)，Xie L(謝林)，et al.Pharmacokinetics of ferric acid in rat after oral administration of Radix Angelica Sinensis，Rhizoma Chuanxiong and their compound preparations.J China Pharm Univ(中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，2003，34:448-451.

5 Liu YJ(劉艷娟)，Du ZM(杜智敏)，Wang Z(王珍).Pharmacokinetic study of ferulic acid in Ruxian pill in rabbits in vivo.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2006，37:527-530.

6 Xia DY(夏東亞)，Guo T(郭濤)，Pan WH(潘文灝)，et al.Determination of plasma level of ferulic acid in Xinshu oral liquid by HPLC and its in vivo pharmacokinetics in rats.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:36-38.

7 Feng BB(馮彬彬)，Zhang JH(張建海)，Zhang JF(張繼芬)，et al.Comparative study on pharmacokinetics of tetramethylpyrazine，ferulic acid and their compatibility.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2010，35:900-903.

8 Feng BB(馮彬彬)，Zhang JH(張建海)，Zhang JF(張繼芬)，et al.Effect of different compatibility of tetramethylpyrazine on its pharmacokinetics in vivo.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2012，37:1311-1313.