北五味子木脂素對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

王春梅，李 賀，李 生，陳寶芝，吳金瀅，陳建光，高曉旭*

（1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013；2.北華大學林學院，吉林 吉林 132013）

北五味子木脂素對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

王春梅1，李 賀1，李 生1，陳寶芝1，吳金瀅1，陳建光1，高曉旭2,*

（1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013；2.北華大學林學院，吉林 吉林 132013）

目的：研究北五味子木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）對酒精誘導小鼠急性肝損傷的保護作用并初步探討其作用機制。方法：將50 只小鼠隨機分為正常對照組、酒精性肝損傷模型組、SCL低劑量組（25 mg/（kg?d））、SCL高劑量組（50 mg/（kg?d））、陽性對照組（聯苯雙酯150 mg/（kg?d）），灌胃給藥預處理15 d。末次給藥1 h，造模組小鼠給予50%乙醇12 mL/kg一次性灌胃，正常對照組給予同體積蒸餾水。12 h后處死小鼠，檢測血清中谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性，甘油三酯（triglyceride，TG）水平，肝組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性；HE染色觀察肝臟病理學改變。結果：SCL可明顯降低酒精致肝損傷小鼠血清ALT和AST活性以及TG水平（P＜0.05），同時使小鼠肝組織MDA含量和NOS活性顯著下降，GSH含量提高（P＜0.05）；蘇木素-伊紅染色結果顯示SCL可顯著改善酒精引起的小鼠肝細胞水腫、壞死，中央靜脈充血等病理損傷。結論：SCL對小鼠酒精性肝損傷具有明顯的保護作用，其機制可能與抗氧化有關。

北五味子木脂素；肝損傷；酒精；氧化應激

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于長期酗酒導致的肝臟疾病，其病程進展包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎以及酒精性肝硬化[1]。隨著我國經濟發展和人們生活方式的改變，ALD發病率呈逐年上升趨勢, 成為僅次于病毒肝炎的第二大肝病[2]。雖然對該病的治療研究和臨床經驗逐漸增多，但目前除戒酒和支持治療外尚無理想的防治藥物，因此尋找對酒精性肝損傷有保護作用的藥物意義重大。五味子（Schisandra chinensis）系木蘭科植物五味子的成熟果實，尤其北五味子是著名的長白山道地藥材，具有益氣生津、補腎養心、收斂固澀等作用[3]。五味子被譽為“護肝降酶之王”，作為我國傳統保肝藥，多與其他中藥配伍用于急、慢性肝損傷的治療，可以促進損傷肝細胞的修復、降低血清轉氨酶活性[4-6]。五味子主要活性成分有木脂素、多糖、萜類等。研究表明五味子木脂素成分對四氯化碳誘導的肝損傷有保護作用[7-9]，藤莖提取物及藤莖總三萜類通過降低血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平可有效防治小鼠酒精性肝損傷[10-11]。但對來源于北五味子種子的總木脂素成分是否具有保護酒精性肝損傷的作用，其機制如何，尚未見報道。本實驗采用酒精誘導小鼠急性肝損傷模型，從肝臟病理、肝細胞損傷、肝臟功能及脂質過氧化等方面觀察北五味子木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）對肝臟的保護作用及并探討其作用機理，以為北五味子開發為防治酒精性肝病的保健食品和藥品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康ICR小白鼠，雄性，體質量（20±2）g，由吉林大學實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（吉）：2010-0005。分籠飼養，飼料充足，飲水不限，室溫20～25 ℃，適應環境5 d后使用。

1.2 材料與試劑

北五味子木脂素由北華大學林學院食品科學與工程實驗室優選新品種，采用超臨界CO2流體萃取，模仿口服藥物在胃腸道的轉運過程，選用特定pH值依次連續提取（半仿生法提取）；經分子蒸餾，其蒸餾溫度110 ℃、進料速率65 L/h、真空度0.7 Pa；再通過AB-8大孔樹脂處理，總木脂素流量1.52 mg/mL、洗脫速率1 mL/min乙醇體積分數95%、洗脫率78.9%）；采用硅膠柱層析法，200～300 目硅膠，以石油醚-乙酸乙酯（60∶1，V/V）洗脫，得木脂素組分，采用紫外分光光度法，在570 nm波長處檢測總木脂素，其純度為93.5%。

聯苯雙酯滴丸 浙江萬邦藥業有限公司；谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）測定試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設備

Infinite M200TECAN酶標儀 瑞士Tecan集團公司；JY92-IID超聲波細胞粉碎儀/粉碎機 寧波新生生物科技股份有限公司；S10手提式高速分散器 寧波新生生物科技股份有限公司；ESJ110-4B電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司。

1.4 動物分組與處理

ICR小鼠50 只，雄性，18～22 g，隨機分為5 組，分別為正常對照組、酒精性肝損傷模型組、SCL低劑量組、SCL高劑量組、陽性對照藥（聯苯雙酯）組。常規飼料喂養，自由飲水。SCL治療組以體質量為基礎分別給予SCL 25 mg/（kg?d）和50 mg/（kg?d）灌胃，陽性對照組給予聯苯雙酯滴丸150 mg/（kg?d）灌胃，正常對照組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃，每日一次，連續15 d。末次給藥1 h后，模型組及給藥組小鼠給予50%乙醇12 mL/kg灌胃，正常對照組小鼠給予同體積蒸餾水灌胃，禁食，不禁水。

1.5 指標測定

上述小鼠造模12 h后摘眼球取血，每只小鼠約取血0.8～1.0 mL，分離血清，分裝入Eppendorf 管，－70 ℃凍存。斷髓處死小鼠，迅速剖腹取出肝臟，于冷的生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干，剪下肝左葉置于10%中性福爾馬林中固定，待做病理。取肝組織100 mg，加入9 倍量的生理鹽水于冰水浴中制成10%組織勻漿，離心后取上清液置4 ℃保存。按試劑盒說明書進行ALT、AST、TG、MDA、GSH及NOS的檢測。

1.6 肝臟病理檢測

將標本置入10%甲醛溶液固定后，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）浸泡過夜，常規梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成4 m石蠟切片。經二甲苯脫蠟及梯度乙醇復水后，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，再進行梯度乙醇脫水，脫水后將組織切片中的乙醇用二甲苯置換出來。最后滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 統計分析

2 結果與分析

2.1 SCL對小鼠體質量的影響

表1 SCL對各組小鼠體質量的影響（x±s，n=10）Table 1 Effect of SCL on bodyweight in mice (x ± s, n=10)

由表1可知，與正常對照組相比，各組小鼠體質量未見明顯差異。

2.2 SCL對小鼠血清ALT、AST活性和TG水平的影響

表2 SCL對各組小鼠血清ALT、AST活力和TG含量的影響(x±s，n=10）Table 2 Effect of SCL on serum ALT and AST activities and TG content in micee (x ±s, n=10)

由表2可知，與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST和TG水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），表明小鼠急性肝損傷模型制備成功。與模型組比較，SCL高劑量組及陽性藥物聯苯雙酯組小鼠血清ALT和AST水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），SCL高劑量組血清TG水平降低（P＜0.05），提示SCL對酒精誘導的小鼠肝損傷有保護作用。聯苯雙酯降低ALT效果優于SCL，但對升高的TG沒有影響。

2.3 SCL對小鼠肝組織MDA、GSH含量及NOS活性的影響

表3 SCL對各組小鼠肝組織MDA、GSH含量及NOS活力的影響（x±s，n=10）Table 3 Effect of SCL on the levels of MDA and GSH and NOS activity in liver tissues in mice (x ±s,n=10)

MDA、GSH及NOS是反應肝臟脂質過氧化的指標。由表3可知，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織MDA和NOS水平顯著升高，而GSH水平明顯降低（P＜0.01），表明酒精致肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力降低，氧化應激增加。與模型組比較，SCL低劑量、高劑量和聯苯雙酯均可顯著降低肝組織MDA含量（P＜0.05或P＜0.01），升高GSH水平（P＜0.05或P＜0.01），SCL高劑量可降低NOS活性（P＜0.01），提示小鼠肝臟的氧化應激狀況得以改善。

2.4 SCL對小鼠肝臟病理形態的影響

圖1 SCL對小鼠肝臟病理形態的影響（HE染色，×100）Fig.1 Effect of SCL on liver pathomorphology in mice (HE staining, × 100)

由圖1可知，正常對照組肝小葉結構完整，肝細胞條索排列規則，肝中央V及匯管區結構形態正常，肝細胞形態圓形，核位于中央，胞漿分染，形態正常（圖1A）。模型組肝細胞水腫，可見肝細胞局部壞死，表現為胞漿染色變混，中央V擴張充血，病變以中央V周圍為主，小葉結構完整（圖1B）。SCL低劑量組和高劑量組肝小葉結構完整，肝細胞形態基本正常（圖1C、1D）。陽性對照組肝細胞形態基本恢復正常（圖1E）。

3 討 論

采用酒精灌胃法建立小鼠急性肝損傷模型，周期短、易復制、死亡率低、穩定性好，且符合人類飲酒所致肝損傷的特點[12]。因此本研究采用50%乙醇12 mL/kg一次性灌胃建立小鼠急性肝損傷模型，結果顯示模型組小鼠血清ALT和AST水平均顯著升高，病理結果也顯示肝細胞水腫、小葉中央靜脈充血等改變，提示造模成功。而給予北五味子木脂素治療后，小鼠血清ALT和AST出現了不同程度的降低，肝細胞水腫及中央靜脈充血減輕，說明北五味子木脂素對酒精所致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

氧化應激一直被認為是酒精性肝病的重要致病因素[13-14]。乙醇進入機體后首先經肝細胞中的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）代謝為乙醛，再經乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）代謝為乙酸。乙醇在代謝過程中會產生大量的還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），引起NADH/NAD+比例升高、增加了呼吸鏈中傳遞的電子流，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度產生。此外，酒精還對多種抗氧化物酶和非抗氧化物造成損傷，導致氧化應激，促進酒精性肝病的發生、發展。同時酒精也可激活細胞色素P450，使反應性氧中間產物和脂質過氧化終產物形成增多，從而介導自由基脂質過氧化引起肝臟損傷，并使體內還原型GSH耗竭[15-18]。MDA是反映組織損傷時出現的過強氧化作用的指標之一，組織中含量越高，氧化活性越強，組織受損程度越大[19]。NOS是機體合成一氧化氮（nitric oxide，NO）的關鍵酶，當NO及活性氧水平均較高時，二者可發生氧化反應，生成細胞毒性很強的過氧亞硝基陰離子，發揮自由基對肝細胞的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白質和脂質的毒性，引起嚴重的肝損傷[20]。本實驗結果顯示模型組小鼠肝組織MDA和NOS明顯升高，而GSH水平下降，表明在灌酒后小鼠氧化應激因子迅速發生了改變，引起了肝細胞損傷。北五味子木脂素治療顯著降低了肝組織MDA和NOS水平，并升高GSH水平，對抗自由基脂質過氧化反應，阻止肝細胞脂質過氧化，維持細胞質膜的正常結構，保護肝細胞免受損傷。

機體攝入大量乙醇后，會使三羧循環障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，乙醇可致α-磷酸甘油增多而促進甘油三酯合成，致使脂肪在肝細胞內沉積。肝臟中蓄積的大量TG以極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的形式運出肝臟，進入血液，使血中TG含量也相應增加[1]。本實驗結果表明模型組小鼠血清TG水平明顯升高，北五味子木脂素治療可降低血中TG水平，改善肝臟的脂肪代謝。

綜上所述，北五味子木脂素對酒精誘導的急性肝損傷具有顯著的保護作用，其作用機制可能與抗自由基脂質過氧化反應有關。這些結果為將北五味子開發為對肝損傷有保護作用的保健食品和藥品提供了重要的實驗依據。

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Protective Effect of Lignans from the Fruits of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. on Ethanol-Induced Acute Liver Injury in Mice

WANG Chun-mei1, LI He1, LI Sheng1, CHEN Bao-zhi1, WU Jin-ying1, CHEN Jian-guang1, GAO Xiao-xu2,*
(1. School of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China; 2. School of Forestry, Beihua University, Jilin 132013, China)

Objective: This study aimed to explore the protective effect of lignans from the fruits of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (SCL) on acute liver injury induced by ethanol in mice and to reveal the underlying mechanism. Methods: A total of 50 mice were randomly divided into normal control, model, low-dose SCL (25 mg/(kg·d)), high-dose SCL (50 mg/(kg·d)) and positive control (bifendate, 150 mg/(kg·d)) groups. The mice were intragastrically administered with corresponding drugs, respectively, for 15 days. Then 50% ethanol (12.0 mL/kg) was given to the mice in model groups 1 hour after the last administration. The mice in the normal control group were administered with an equal volume of distilled water. All the mice were sacrificed 12 hours later, and their blood samples were collected. The activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) and triglyceride (TG) level in serum as well as the contents of malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) and nitric oxide synthase (NOS) activity in liver tissues were measured. Hematoxylin and Eosin (HE) staining was performed for observing pathological changes of the liver tissues. Results: SCL significantly decreased the activities of ALT and AST and TG levels in serum (P ＜ 0.05). Meanwhile, the MDA content and NOS activity in liver tissues were reduced significantly whereas the GSH content was significantly increased by SCL (P ＜ 0.05). Moreover, HE staining showed that SCL significantly improved the liver cell edema, necrosis, and central venous congestion. Conclusions: SCL confer a significant protective effect on alcohol-induced acute liver injury in mice, which might be attributed to their anti-oxidant capacity.

Schisandra chinensis lignans; liver injury; alcohol; oxidative stress

R285.5

A

1002-6630（2014）13-0262-04

10.7506/spkx1002-6630-201413052

2013-09-22

吉林省科技廳重點科技攻關項目（吉科合字 [2012]0904號）；吉林省衛生廳科研課題（201262502）

王春梅（1974—），女，副教授，博士，研究方向為內分泌藥理學。E-mail：wangcm74@126.com

*通信作者：高曉旭（1967—），男，副教授，博士，研究方向為植物活性成分。E-mail：gaoziyang4685@163.com