腫瘤抗血管生成治療耐藥分子機制研究進展

羅翠蓮綜述；文慶蓮審校

(1．瀘州醫學院，四川瀘州646000;2．瀘州醫學院附屬醫院腫瘤科，四川瀘州646000)

自1971年Folkman首次提出“新生血管對腫瘤生長至關重要”的概念［1］以來，抗血管生成是除手術、放化療以外的有效治療腫瘤方法之一。血管生成抑制劑影響新生血管形成，從而阻斷腫瘤的生長和轉移，可改善患者的生存狀況，但并沒有延長PFS、改善OS，這可能與出現了耐藥有關。目前，腫瘤抗血管生成治療耐藥機制尚未闡明，本文主要綜述腫瘤抗血管生成治療耐藥分子機制的研究進展。

1 腫瘤耐藥現象

血管生成抑制劑主要針對的是血管內皮細胞，而內皮細胞遺傳上相對穩定，因此，我們過去認為這類藥物很難產生耐藥性。隨著血管生成抑制劑的廣泛運用和深入研究，逐漸認識到這些藥物雖然取得了一定療效，但并沒有帶來大家期望的臨床結果［2］。目前，許多研究表明腫瘤能夠適應血管生成抑制劑的存在，逃避抗血管生成治療，即腫瘤對血管生成抑制劑產生了耐藥現象。

越來越多的研究表明，許多腫瘤患者在接受血管抑制劑治療時或治療數月后，出現耐藥現象。Kindler等［3］入組602例晚期胰腺癌患者進行了臨床研究，分為吉西他濱(gemcitabine)+安慰劑組與吉西他濱+貝伐單抗(bevacizumab)組，但結果顯示兩組的中位PFS、有效率(response rate，RR)差異無統計學意義，表明聯合貝伐單抗并沒有改善OS。Bao等［4］入組126例晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung canser，NSCLC)患者，分為紫杉醇(paclitaxe)+順鉑(cisplatin)+恩度(endostar)組和紫杉醇+順鉑+安慰劑組，發現恩度組并沒有提高PFS和OS。黃銀梅［5］對64例初治NSCLC患者進行研究，其中吉西他濱+鉑類+恩度組22例，吉西他濱+鉑類組42例，兩組均無完全緩解(complete remission，CR)患者，兩組中位生存時間(median survival time，MST)、疾病控制率(disease control rate，DCR)、部分緩解率(partial remission rate，PRR)及總的客觀有效率(objective response rate，ORR)差異在統計學上并沒有意義。由此得知，表面上有效的血管生成抑制劑治療后，腫瘤繼續生長和演進似乎不可避免，原因可能在于腫瘤對血管生成抑制劑產生了耐藥。

2 腫瘤抗血管生成耐藥的分子機制

2．1 替代性促血管生成因子或通道的增強表達

2．1．1 替代性促血管生成因子的增強表達

腫瘤新生血管生成的主要促進因子是血管內皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)，其與受體(vascular endothelial cell growth factor receptor，VEGFR)結合后傳導信號，引起腫瘤內皮細胞增殖、遷移，誘導新生血管生成，目前“VEGF-VEGFR”軸是抗血管生成治療主要作用靶點。但腫瘤發生發展同時存在多種血管生成因子、多條血管生成信號通路的失調，可以推測，當VEGF信號通路被阻斷后可能會出現其他生成因子、信號通路活性的增強。許多研究表明，在腫瘤的發展中可以產生成纖維細胞生長因子(fibroblast growth fac-tor，FGF)、胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)、血小板衍生生長因子(plated-derived growth，PDGF)、基質細胞衍生因子(stromal cell derived factor1 alpha，SDF-1α)、血管生成素 (angiopoietin，Ang)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等其他促血管生成因子。抗血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)在治療胰腺腫瘤短期有效后，因FGF1、FGF2、Ang-1等表達上調導致腫瘤復發，而在開始治療同時應用阻斷FGF1/FGF2信號通路的FGF相關蛋白，則可以使腫瘤的復發率降低［6］。Chung等研究表明，在一些模型中短期VEGF-VEGFR的抑制反而加速了腫瘤的侵襲和轉移，腫瘤通過腫瘤細胞分泌SDF-1α影響循環中內皮前體細胞誘導新生血管形成來逃避抗血管生成治療［7，8］。

2．1．2 Dll4/Notch 信號通路

最近研究發現了與腫瘤血管生成相關的另一關鍵通路——Dll4/Notch信號通路［9］。許多細胞表面可以表達Notch受體，受體與其跨膜配體結合后傳導信號，發揮調節細胞增殖、分化和凋亡的作用。Notch受體有多種跨膜配體，與血管生成相關的Delta樣配體4(delta-like ligand 4，Dll4)只表達于內皮細胞表面。研究表明，腫瘤細胞中Dll4的表達水平相當高，提示抗Dll4/Notch信號通路靶向藥物可能存在很大抗癌作用。Dll4基因及蛋白在A549細胞中表達，特異性阻斷Dll4/Notch信號通路能有效促進A549細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成來達到阻遏腫瘤的生長［10］。Dll4信號通路抑制劑怎樣降低腫瘤血供，影響腫瘤生長目前尚在研究中。有研究發現，腫瘤應用抗Dll4信號通路的藥物后，增加了腫瘤的新生血管數量，但這些血管畸形且不能很好地提供血液，腫瘤的生長因血供明顯降低而被遏制了［11］。另有研究發現，Notch信號通路抑制劑二苯丙氮卓(DBZ)可使新生大血管斷裂，提高貝伐單抗的療效［12］。據報道，對抗 VEGF治療耐藥的腫瘤可以對Dll4/Notch通路的抑制劑產生反應。由此可知，腫瘤生長可以不依賴于 VEGF通路，Dll4/Notch信號途徑可使腫瘤獲得血供繼續生長，從而可能導致了腫瘤對血管生成抑制劑的耐藥性。

2．2 腫瘤缺氧環境

2．2．1 缺氧易動員骨髓來源細胞

血管生成抑制劑抑制血管生成后，腫瘤血供相對不足而形成了缺氧微環境，它可以動員參與腫瘤新生血管形成的骨髓來源細胞。與此相關的骨髓來源細胞包括血管干細胞和血管形成調控細胞，前者如:內皮干細胞、管周干細胞等參與血管形態構成，后者如:腫瘤相關巨噬細胞、CD11b+髓細胞等通過分泌各種細胞因子、生長因子、蛋白酶來調控血管生成。研究者應用小鼠模型發現，對抗血管生成治療抵抗的腫瘤中存在更多的CD11b+Gr1+髓系細胞，且分離這些細胞后發現其可以介導腫瘤抵抗性的形成［13］。缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是腫瘤缺氧的主要調控者，對腫瘤的發生發展、新生血管生成、凋亡等起著重要作用。Du等［14］在研究神經膠質瘤過程中發現，在缺乏HIF的對照組中，骨髓源性細胞較少，腫瘤血管生成被抑制;而實驗組中腫瘤的新生血管明顯增多，這與HIF募集髓源性CD45+、CDl33+細胞參與血管生成相關。另外有報道，CD11b+Gr1+細胞可以激活腫瘤基質細胞分泌白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、SDF-1α、粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)等因子促進血管增生，使腫瘤對血管生成抑制劑產生耐藥［15］。

2．2．2 缺氧致血管重構(vascular remodeling，VR)

血管重構是慢性缺氧的重要標志，腫瘤由于自身的生長特性易出現缺血缺氧，且抗血管生成治療會進一步加重其缺血缺氧，因此很可能會出現VR。重構的中心血管管腔直徑增大，血管壁細胞(vascular mural cell，VMC)增殖，ephrinB2等因子表達增加，重構血管的穩定性增加。據報道，抗VEGF治療停止后會出現快速的腫瘤血運重建［16］。Huang等［17］研究表明，長期使用血管生成抑制劑后，腫瘤出現了VR，這些血管穩定性提高，更好地增加了腫瘤血供，促進其生長、進展。長期抗血管治療的腫瘤發生耐藥，其獲得性耐藥機制可能是腫瘤通過重塑的穩定性增加的血管來適應治療。

2．3 血管生成方式多樣性

2．3．1 血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)

傳統的出芽式血管生成(sprouting angiogenesis)是指在促血管生成因子刺激下，內皮細胞遷移、分化、增殖排列成條索狀形成新生血管。VM血供模式由腫瘤細胞分化成血管內皮樣細胞構成血管通道，重塑腫瘤微循環，可供給腫瘤血液、營養，其特點是生成過程沒有內皮細胞的參與。惡性黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤內發現了VM供血模式。研究顯示，有VM瘤體直徑可達1cm而中央不易缺血壞死，這類腫瘤更容易生長、發展、轉移，缺乏VM的瘤體中央因缺血而容易壞死［18］。Liu等［19］入組的80例惡性星形細胞瘤病例中發現8例VM，同時發現，內皮抑素(endostatin)對存在VM的U251星形細胞瘤治療作用不顯著。抗血管生成治療的目標通常是新生血管內皮細胞，存在VM的瘤體治療失敗的原因可能是由于這類腫瘤不依靠血管內皮細胞。

2．3．2 套入式血管生成(intussusceptive angiogenesis)

套入式血管生成現象是Caduff在1986年發現的，其生成過程大致如下:相鄰的腫瘤血管壁逐漸向血管腔內凹陷;相互靠近接觸、相吻、融合;融合的地方管壁變薄，雙分子間出現小孔;小孔逐漸增大最后形成穿過毛細血管管腔的管道，即套入式血管。與傳統的出芽式血管相比，其有三大特點:(1)套入式血管生成的速度很快，一般只需數小時，有時在數分鐘內就可形成;(2)血管生成時只有很少的內皮細胞增殖，甚至無需增殖;(3)血管通透性低。腫瘤的生長及轉移與套入式血管的這些特點密切相關［20］。Burri等研究發現腫瘤直徑小于0．8cm 時主要是出芽式血管生成方式，當腫瘤更大時則依靠套入式血管獲得血供［21］。可以推測，腫瘤較小時，腫瘤依賴于出芽式血管生長，當腫瘤較大時需要高密度血管，出芽式血管不能滿足腫瘤生長需要，這時可能激活套入式血管生成。套入式血管生成過程中很少甚至沒有內皮細胞分化、增殖，更多的是內皮細胞遷移形成管道，抗VEGF抑制內皮細胞增殖的治療并不能對套入式血管生成發揮作用，從而能很好地逃避抗血管生成治療;那么，抑制內皮細胞遷移的治療能更好地抗套入式血管形成［22］。

2．3．3 血管共選擇(vessel co-option)

腫瘤血管生成抑制劑按作用機制大致可分為間接和直接血管生成抑制劑兩類。前者主要通過抑制一種甚至幾種促血管生成因子來阻斷血管生成的下游信號通路，間接影響內皮細胞增殖及新生血管生成，從而抑制腫瘤生長、進展和轉移。直接腫瘤血管生成抑制劑直接對內皮細胞產生作用，影響腫瘤細胞的調節通路，從而遏制新生血管的生成。其作用如下:①抑制腫瘤內皮細胞的分化、增殖、遷移或誘導其凋亡;②防止腫瘤的遷移或內皮細胞管型的形成;③抑制活化的內皮細胞中的基質金屬蛋白酶(MMPs)活性。血管生成抑制劑通過抑制新生血管生成、切斷血供通道而達到“餓死”腫瘤的作用。隨著研究的深入發現，腫瘤生長可利用周圍現存的血管獲得血供，而自身并沒有新生血管生成［23］。Wesseling等［24］研究也表明，有些血供豐富的組織如腦、肺等處的腫瘤可不啟動新生血管生成，其腫瘤細胞沿著原有的血管生長，即依賴周圍已存在的血管生長，我們稱之為血管共選擇。另外，在惡性膠質瘤、黑色素瘤移植模型中均發現應用抗VEGF藥物治療后，腫瘤可以通過血管共選擇來促進腫瘤的生長、進展［25，26］。血管生成抑制劑的作用原理是針對新生血管，而血管共選擇并不存在新生血管的形成，因此血管生成抑制劑并不能對利用血管共選擇獲得血液的腫瘤很好地發揮作用，這部分腫瘤易產生耐藥。

2．4 腫瘤細胞自身改變

2．4．1 腫瘤細胞的異質性(heterogeneity)

腫瘤在演進過程中，其子代細胞可發生諸多改變如:基因、大分子變化來適應新的環境及抗癌治療，不斷進化的子代細胞生長速度更快、侵襲力更強、對抗癌藥更易產生耐藥等，這些細胞擁有異質性能更好地生存、發展。異質性腫瘤細胞比一般細胞更有生存優勢，逐漸被腫瘤選擇并保留下來，長期抗血管治療后，此類細胞對血管的依賴性減少，在缺血、缺氧環境中亦能繼續生長，抵抗抗血管治療［27］。目前也有研究表明在低氧條件下培養的腫瘤細胞更富有侵襲性、轉移性。

p53基因是人類重要的抑癌基因，與抑制腫瘤血管生成也密切相關，p53基因發生突變、缺失將影響血管生成及腫瘤的發生發展。研究顯示，p53突變型的腫瘤血管密度、血管數目高于p53野生型的腫瘤［28，29］。另有研究表明，p53基因突變或缺失的腫瘤細胞可以更好的生存、抗凋亡能力增強。可以推測，p53野生型的腫瘤細胞對氧和血供的要求高于p53突變型，p53突變型細胞及其亞群細胞更有生存優勢，特別是在抗血管生成治療過程中。Klement等比較了p53+/+和p53-/-HCT116人結直腸癌細胞對抗腫瘤血管生成藥物的反應，p53基因的存在可以使治療效果更佳，p53基因的缺失則不利于抗腫瘤治療［30］。

2．4．2 腫瘤細胞自噬

自噬是指自噬體(autophagosome)與溶酶體(lysosome)結合形成自噬溶酶體(autolysosome)，自噬溶酶體促使細胞中多余或受損的大分子、細胞器降解，降解產物被循環利用，從而讓細胞的內環境處于一個相對穩定的狀態［31］，研究提示，自噬現象對腫瘤形成具有促進和抑制兩個方面的作用。一方面，在腫瘤早期自噬抑制腫瘤細胞的生長，腫瘤細胞通過自噬清除受損的細胞器，減輕炎癥反應，維持細胞的內穩態，保護正常細胞的生長。另一方面，在腫瘤進展中，在缺血缺氧或營養不足的狀態下，腫瘤細胞則通過自噬降解、循環再利用細胞內物質，促進自身存活，即自噬有助于腫瘤細胞在不利環境下存活從而促進腫瘤生長。抗血管生成治療致新生血管生成減少，腫瘤出現缺血缺氧促進腫瘤細胞自噬，腫瘤細胞存活能力增強從而對抗血管生成治療產生耐藥。Hu等［32］研究發現在抗血管治療后，加劇了腫瘤微環境缺氧，HIF-1α和 AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)的表達上調，細胞自噬增加，從而導致腫瘤對抗血管治療的抵抗。伊馬替尼(imatinib，IM)等TKI治療白血病臨床療效有限，其耐藥現象越來越嚴重，耐藥原因主要是細胞自噬的形成［33］，對于耐IM慢性髓系白血病在自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyla-denine，3-MA)及氯喹(chloroquine)治療以后，增強了伏立諾他(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)對腫瘤的細胞毒作用［34］。因此，有學者指出腫瘤早期可使用自噬增強劑來加強細胞自噬能力;在腫瘤晚期則應用自噬抑制劑阻止細胞自噬，以達到克服抗血管生成治療耐藥及抗癌作用。

2．4．3 腫瘤細胞圍管浸潤

Du等［14］發現多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)小鼠的血管生成基因VEGF、HIF-lα被敲除或藥物抑制VEGF后，腫瘤向周圍組織侵襲方式是以細胞團的形式沿著正常血管生長，而對照組的腫瘤侵襲形式是單個細胞沿著血管基底膜及腦室生長。Norden等入組貝伐單抗治療后復發的GBM患者，MRI觀察到了類似以上的圍管浸潤現象［35］。GBM 細胞表達 VEGFR-1/2，VEGF信號可對腫瘤細胞圍管浸潤有一定制約作用，當VEGF信號通路被血管生成抑制劑阻斷后，相應的是增強了腫瘤細胞圍管浸潤信號的表達，從而對血管生成抑制劑產生抵抗［36］。

2．5 其它耐藥機制

腫瘤細胞的多重耐藥(multdrug resistance，MDR)機制與ATP結合蛋白(ATP-binging cassette，ABC)型膜載體蛋白家族參與相關，ABC的作用機制是將細胞內多種抗腫瘤藥物(如化療藥物等)泵到細胞外，細胞內的藥物濃度降低而不能充分發揮抗癌作用。Suneet Shukla等［37］研究發現TKI也可被ABC轉運，導致藥物動力學的改變及產生耐藥。管周細胞通過分泌旁分泌因子刺激血管內皮細胞分化及生存信號通路，調節血管的穩定和成熟，內皮細胞可通過增加周細胞的保護而免受抗VEGF治療，是耐藥產生的又一原因。正常內皮細胞因遺傳上相對穩定不易產生耐藥性，腫瘤的內皮細胞易發生遺傳改變而更好地逃避抗血管治療。Xiong等［38］研究發現，在促血管形成、粘附腫瘤細胞、抗凋亡能力方面，CD105+肝癌內皮細胞強于CD105+正常內皮細胞、人臍靜脈內皮細胞，也容易對索拉非尼(sorafenib)也產生耐藥。另外，耐藥性的產生還與原發性耐藥、VEGF單核苷酸多態性、臨床用藥劑量等密切相關。腫瘤耐藥機制涉及到多種因子、多種調控，且各種因素互相交織、復雜多變，目前耐藥機制研究尚淺，需進一步探索，以期提高抗血管治療療效。

3 抗血管生成治療相關耐藥標志物

耐藥預測標志物對預測耐藥、調整治療方案、發現新靶點有指導作用。VEGF對新生血管形成及腫瘤生長和轉移起著重要作用，我們推測血漿、組織中VEGF水平可能成為抗血管生成療效的理想標志物，但研究結果存在很大爭議。有臨床研究顯示，循環中的VEGF基線水平與總反應率(overall reaction rate)有一定關聯，但與預測OS不相關［39］。在貝伐單抗治療轉移性乳腺癌的研究發現，基線血漿VEGF水平與治療療效無關［40］。因此，VEGF并不是理想的療效標志物。由耐藥機制可知，許多循環血管生成因子、細胞與耐藥性存在一定關聯如:FGF、PDGF、PLGF、SDF-1、Ang、TNF-α、循環祖細胞(circulating progenitor cells，CPCs)及循環內皮細胞(circulating endothelial cells，CECs)等，它們與腫瘤血管發生、發展有著密切關系，可能對血管生成抑制劑療效的預測有重要作用。屬于TKI的西地尼布(cediranib)治療復發惡性膠質瘤時，血漿的循環祖細胞、循環內皮細胞、成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及SDF-1α水平高的患者，其腫瘤復發及轉移力增強［41］。貝伐單抗可以減少血管內皮細胞中一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成致血管收縮使血壓升高，血壓升高可能成為抗血管生成藥物療效的預測指標［42］。循環中的促血管生成因子、細胞與血壓升高有望成為抗血管生成治療療效的指標，但其是否能成為腫瘤療效指標，如何指導我們聯合用藥需要深入研究。

4 結語

目前，抗血管生成耐藥現象得到越來越多的研究證實，對耐藥機制的研究尚不深入，加強研究，有助于克服耐藥，并利于研發新藥、指導臨床用藥。絕大多數腫瘤表達的促血管生成因子有所不同，間接血管生成抑制劑阻斷其中一個或幾個因子則會啟動替代性生成因子，激活相應血管生成信號通路，導致腫瘤產生耐藥。直接的血管生成抑制劑直接作用于內皮細胞，避免了因抑制單一信號傳導通路引起的其它血管生成信號通路的激活。有學者提出，間接血管生成抑制劑比直接抑制劑更容易出現耐藥，應重點開發直接抑制劑，且二者聯合用藥可能會增加療效。開發多靶點藥物及聯合用藥可能會逆轉或延緩耐藥性。浸潤于腫瘤組織中的髓系細胞能夠促進血管生成、加速腫瘤發展，從而降低了臨床腫瘤治療的療效，那么抗血管生成治療的同時，聯合刪除腫瘤中的髓系細胞或阻斷其促進腫瘤血管生成作用，可能會有效地抑制腫瘤復發［43］。化療藥物緩釋給藥取得良好效果，抗血管生成藥物采用緩釋系統如納米粒、微球等緩慢給藥能否提高療效和克服耐藥值得研究。另外，研究特異性標志物來預測耐藥情況以指導用藥，循環中血管生成因子、細胞有望成為預測抗血管生成耐藥指標，但需要更多的研究來確證。

抗血管生成耐藥機制是什么，如何克服、逆轉耐藥，怎樣預測耐藥等一系列問題都值得我們深入思考與探討。隨著研究的深入，耐藥機制會逐漸被闡明，抗血管生成治療效果將會不斷提高，從而改善腫瘤患者PFS、OS并提高其生活質量(quality of life，QOL)。

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