骨形態發生蛋白2/7異源二聚體的研究進展

高 濤 周陸陸 綜述 苗春雷 唐勝建 劉方軍 審校

骨形態發生蛋白2/7異源二聚體的研究進展

高 濤 周陸陸 綜述 苗春雷 唐勝建 劉方軍 審校

骨形態發生蛋白2/7（BMP2/7）異源二聚體，較其同源二聚體具有更強的誘導成骨潛能，是目前組織工程骨研究的重要分支之一。本文介紹了異源二聚體BMP2/7誘導成骨的相關實驗，比較其與同源二聚體生物活性的差異，并對相關機制進行綜述。

骨形態發生蛋白異源二聚體骨組織工程成骨分化

骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP），是一組二硫鍵連接的二聚體，屬于轉化生長因子TGF-β超家族的一員，是促進骨再生的重要因子。目前已發現的BMP有十幾種，其中BMP2、4、7的生物活性最高、成骨活性最強[1]。

BMP蛋白多以同源二聚體的形式存在，并發揮其誘導成骨的潛能。臨床實驗證明，BMP2、BMP7同源二聚體在誘導異位成骨、增進脊柱融合、整合種植體周圍骨組織等方面有明顯作用。但BMP同聚體在臨床應用的有效劑量非常高，患者經濟負擔重，而且還有產生副作用的可能，如異位誘導成骨、刺激破骨細胞分化等[2]。研究發現，天然情況下也存在BMP2/ 7異源二聚體，并且異源二聚體的誘導成骨活性比重組hBMP高4～6倍以上[3]。BMPs活性與兩單體的同源性相關，兩單體擁有的基因和蛋白同源性越低，則形成的BMPs的骨誘導活性越強，理論上異源二聚體比同源二聚體的骨誘導活性更強[4]。同樣，Aono等[5]研究表明，BMP4/7異源二聚體也具有較強的誘導成骨潛能，據此推測體內組織中可能有BMP異源二聚體的存在。目前的研究已證明，異源二聚體替代同源二聚體誘導成骨是可行的[6]。

1 異源二聚體BMP2/7的生物活性比較

在體外實驗中，以腺病毒AdBMP2、AdBMP4和AdBMP7單種、兩種或三種，同時轉染成纖維細胞C3H10Tl/2、骨髓基質細胞ST2或成肌細胞C2C12，發現異源二聚體BMP2/7、BMP4/7以及BMP2/4/7組誘導的細胞ALP活性是單個基因表達的2～30倍，尤以C2C12細胞差異最為明顯[7]。Israel等[3]報道，BMP2/7與BMP2分別作用于小鼠基質細胞W-20-17，發現在低濃度時BMP2/7誘導的堿性磷酸酶活性是BMP2的20倍，而兩者所能達到的最高ALP活性值并無顯著性差異。Koh等[8]利用腺病毒AdBMP2及AdBMP7基因共轉染小鼠BLK細胞以制備BMP2/7異源二聚體并作用于小鼠成肌細胞株C2C12，結果發現BMP2/7異源二聚體比其同源二聚體具有更強的成骨活性，且比BMP2、BMP7或兩者的蛋白混合物更易促進Smad1/5/8的磷酸化，從而表現出更強的生物學活性。

目前的研究多在實驗條件下，不能排除條件培養基中其他因素對細胞的影響，這些影響因子是否會影響異源二聚體BMP2/7的作用，則需要進一步證實。

通過腺病毒介導BMP2、4、7基因共轉染小鼠胚胎成纖維細胞株，Zhao等發現體外培養基因共轉染細胞株表現出較強的成骨活性，而Ad-BMP2/7共轉染細胞株移植到C57BL6小鼠皮下后表現出更多的新骨組織形成[9]。在種植體周圍骨缺損修復方面，低劑量的BMP2/7異源二聚體比同源二聚體誘導的再生骨質量更好，修復也更快[10]。在大鼠脊柱融合實驗中，采用Ad-BMP2/7共轉染的方法，可以顯著增加大鼠脊椎融合率[11]，然而使用人源及馬源性BMSC作為效應靶細胞時未發現類似的結果，認為可能是BMP2/7異源二聚體對人源及馬源性BMSC不敏感，即其誘導成骨活性存在種屬特異性所致[12]。在BMP2/7異源二聚體修復小鼠骨缺損的實驗中，發現異源二聚體BMP2/7修復骨缺損的能力明顯優于同源二聚體BMP2及BMP7，且新骨形成量為同源二聚體成骨量的2倍左右，然而其組織切片中亦出現了成骨過量、骨結構紊亂的現象，認為與使用BMP2/7異源二聚體劑量過高有關。因此，在以后的研究中需要優化BMP2/7的治療劑量[3]。基因治療雖然在一定程度上模擬了蛋白的生理效果，但BMPs的釋放量難以做到精確，過量的蛋白釋放勢必會造成不良后果，因而需要進一步研究BMP2/7的起效濃度，以避免不良后果。

2 BMP2/7異源二聚體誘導成骨的機理

迄今為止，BMP2/7異源二聚體較其相應同源二聚體具有更強誘導成骨活性的生物作用機理仍不完全清楚，極大地限制了其在骨組織工程中的應用。BMP通過結合靶細胞表面激酶受體（即BMPⅠ型、Ⅱ型受體）而激活細胞內傳統smad信號傳導通路以發揮其生物調控作用[13]，而依據BMP所作用的靶細胞系的不同，BMP受體亦可激活非Smad信號傳導，如激活細胞外信號調節激酶ERK、絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）p38、c-Jun氮末端激酶JNK等，而發揮誘導成骨作用[14]。Koh等[15]利用腺病毒AdBMP2及AdBMP7基因共轉染，以制備BMP2/7異源二聚體，并作用于小鼠成肌細胞株C2C12。結果發現，BMP2/7異源二聚體比其同源二聚體具有更強的誘導C2C12細胞成骨的活性，而且BMP2/7異源二聚體比BMP2、BMP7同源二聚體或二者的蛋白混合物更易于促進Smad1/5/8的磷酸化，而表現出更強的生物學活性。但是，研究并未發現MAPK信號通路激活，據此認為以C2C12細胞系作為靶細胞時，BMP2/7異源二聚體通過有效激活Smad信號傳導通路，以發揮其更強的誘導成骨能力。同時亦有研究發現，ALK-2與ALK-3/6共轉染C2C12細胞后表現出增強的堿性磷酸酶活性，且共轉染后激活并增強了受體下游信號傳導基因的轉錄活性[16]。因此，BMP2/7異源二聚體有效激活Smad信號傳導通路可能與其結合BMP2以及BMP7各自受體的特性而誘導形成信號傳導能力增強的四聚體受體復合物有關[17]，使3種不同的BMPsⅠ型受體ALK-2、ALK-3、ALK-6同時激活而發揮更強的生物學活性。

另外，BMP2/7異源二聚體的生物活性增強，亦可能與其信號傳導抑制因子，如負顯性受體BAMBI、競爭性受體抑制劑Noggin、Gremlin等的表達，及其負反饋抑制BMPs信號通路的過度激活有關。有研究認為，雖然BMP2和BMP2/7異源二聚體都能夠上調MC3T3.E1細胞中內源性CIZ的轉錄水平，但BMP2明顯比BMP2/7異源二聚體的上調作用要強，據此認為BMP2/7異源二聚體成骨活性較高可能與CIZ負反饋抑制成骨有著密切的關系[18]。以C2C12成肌細胞系作為靶細胞，Zhu等發現BMP2/7異源二聚體較BMP2、BMP7同源二聚體更能誘導明顯低表達的BMP受體抑制劑Noggin，且添加外源性Noggin并未影響BMP2/7異源二聚體誘導C2C12細胞時所表現出的增強的誘導成骨潛能[11]。

綜上所述，腺病毒Ad-BMP2及Ad-BMP7基因共轉染效應靶細胞可形成BMP2/7異源二聚體，且其與BMP2、BMP7同源二聚體相比，具有更強的誘導成骨活性。然而，目前對其生物作用機理的研究尚不完善，且多局限于采用建系成骨細胞株作為研究靶細胞，而依據BMP蛋白所作用靶細胞系的不同，BMP2/7異源二聚體有著與BMP2、BMP7同源二聚體不同的信號激活方式，及對Noggin等負反饋抑制因素的不同調控與親和能力，從而發揮其增強的誘導成骨潛能。

3 展望

骨形態發生蛋白及其人工骨的研究和局部基因治療的進展，為治療骨缺損提供了新途徑。通過轉基因技術使靶細胞局部有效分泌骨誘導生長因子，以調控細胞的增殖活性和成骨能力，并與支架材料復合構建成基因強化的組織工程人工骨，用以修復骨缺損，這樣既保持了移植物的成骨傳導作用，又提供了基因治療中的成骨誘導作用，從而增強骨生長修復的效果。應用基因治療增加骨誘導細胞因子的局部分泌，以促進骨修復，是目前骨組織工程研究領域的熱點，為組織工程骨的臨床應用提供更加有效的新途徑。

[1]Lavery K,Swain P,Falb D,et al.BMP-2/4 and BMP-6/7 differentially utilize cell surface receptors to induce osteoblastic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells [J].Biol Chem,2008,283(30):20948-20958.

[2]Kaneko H,Arakawa T,Mano H,et al.Direct stimulation of osteoclastic bone resorption by bone morphogenetic protein (BMP)-2 and expression of BMP receptors in mature osteoclasts [J].Bone,2000,27(4):479-486.

[3]Israel DI,Nove J,Kerns KM,et al.Heterodimeric bone morphogenetic proteins show enhanced activity in vitro and in vivo[J]. Growth Factors,1996,13(3-4):291-300.

[4]柳毅,鄭園娜,谷志遠.骨形態發生蛋白異源二聚體(BMP2/7)誘導成骨的研究進展[J].口腔醫學,2014,34(4):301-303.

[5]Aono A,Hazama M,Notoya K,et al.Potent ectopic bone inducing activity of bone morphogenetic protein2,4/7 heterodimer[J]. Biochem Biophys Res Commun,1995,210(3):670-677.

[6]Kawai M,Maruyama H,Bessho K,et al.Simple strategy for bone regeneration with a BMP-2/7 gene expression cassette vector[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,390(3):1012-1017.

[7]Franceschi RT,Yang S,Rutherford RB,et al.Gene therapy approaches for bone regeneration[J].Cells Tissues Organs,2004, 176(1-3):95-108.

[8]Koh JT,Zhao Z,Wang Z,et al.Combinatorial gene therapy with BMP2/7 enhances cranial bone regeneration[J].Dent Res,2008,87 (9):845-849.

[9]Zhao M,Zhao Z,Koh JT,et al.Combinatorial gene therapy for bone regeneration:cooperative interactions between adenovirus vectors expressing bone morphogenetic proteins 2,4,and 7[J]. Cell Biochem,2005,95(1):1-16.

[10]Wang J,Zheng Y,Zhao J,et al.Low-dose rhBMP2/7 heterodimer to reconstruct peri-implant bone defects:a micro-CT evaluation [J].J Clin Periodontol,2012,39(1):98-105.

[11]Zhu W,Kim J,Cheng C,et al.Noggin regulation of bone morphogenetic protein(BMP)2/7 heterodimer activity in vitro[J]. Bone,2006,39(1):61-71.

[12]Carpenter RS,Goodrich LR,Frisbie DD,et al.Osteoblastic differentiation of human and equine adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells when BMP-2 or BMP-7 homodimer genetic modification is compared to BMP-2/7 heterodimer genetic modification in the presence and absence of dexamethasone [J].Orthop Res,2010,28(10):1330-1337.

[13]Miyazono K,Kamiya Y,Morikawa M.Bone morphogenetic protein receptors and signal transduction[J].Biochem,2010,147(1):35-51.

[14]Nohe A,Keating E,Knaus P,et al.Signal transduction of bone morphogenetic protein receptors[J].Cell Signal,2004,16:291-299.

[15]Koh JT,Zhao A,Wang Z,et al.Combinatorial gene therapy with BMP2/7 enhances cranial bone regeneration[J].Dent Res, 2008,87(9):845-849.

[16]Aoki H,Fujii M,Imamura T,et al.Synergistic effects of different bonemorphogeneticproteintypeIreceptorsonalkaline phosphatase induction[J].Cell Sci,2001,114(Pt 8):1483-1489.

[17]Suzuki Y,Ohga N,Morishita Y,et al.BMP-9 induces proliferation of multiple types of endothelial cells in vitro and in vivo[J].Cell Sci,2010,123(Pt 10):1684-1692.

[18]潘秋輝,楊松海,董群偉,等.BMP2/7異源二聚體調控CIZ的表達與自身活性的關系[J].中國生物工程,2007,27(9):14-18.

Research Progress of Bone Morphogenetic Protein 2/7 Heterodimer

GAO Tao,ZHOU Lulu,MIAO Chunlei,TANG Shengjian,LIU Fangjun.

Plastic Surgery Hospital,Weifang Medical University,Weifang 261000,China.Corresponding author:Liu Fangjun(E-mial:liufjmd@gmail.com).

【Summary】BMP2/7 heterodimer,a bone structure formation protein,has stronger osteogenesis inductive potential than its homodimer.So the study of BMP2/7 heterodimer has been one of the most important research directions in tissue engineering osteogenesis now.In this article,the osteo-inductive related experiments of BMP2/7 heterodimer were described,the differences of biological activity between heterodimer and homodimer were compared,and the mechanisms were overviewed.

Bone morphogenetic protein;Heterodimer;Bone tissue engineering;Osteogenic differentiation

O629.73

B

1673－0364（2014）06－0355－03

2014年6月25日；

2014年9月8日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.015

國家自然科學基金資助項目（81372091）。

261000山東省濰坊市濰坊醫學院整形外科醫院。

劉方軍（E-mial：liufjmd@gmail.com）。