我國結核病基礎研究的回顧與展望

張俊仙 梁艷 吳雪瓊

《中國防癆雜志》是我國惟一的中央性結核病防治專業(yè)高級學術期刊，在其創(chuàng)刊80周年之際，回顧我國結核病防治工作者與結核病不懈斗爭的光輝歷程，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

結核病基礎研究所獲得的知識和取得的成果已經(jīng)廣泛滲透到結核病臨床和防控的各個環(huán)節(jié)，為我國結核病疫情的控制提供了有力的科學支撐。我們?yōu)榛A科學研究所取得的一些成績而喝彩，為面臨的困境而孜孜不倦地探索，對科技進步的希冀更激勵我們奔向燦爛的未來。

我們從中國知網(wǎng)檢索“結核”相關的論文，從1917年以來《中國防癆雜志》發(fā)表論文最多。雖然中國知網(wǎng)收錄的論文并不全面，但也能部分地反映《中國防癆雜志》在結核病學術交流中發(fā)揮的作用，以及為結核病學科發(fā)展所做出的貢獻。

1965年之前基礎科研薄弱，論文發(fā)表很少，主要是開展細菌學研究、抗結核藥物的仿制、中藥的開發(fā)。1966年至1973年“文革”的8年間，結核病基礎科研停滯，沒有論文發(fā)表。1974年至1979年基礎科研復蘇，但每年只有幾篇論文問世，主要是對新出現(xiàn)的乙胺丁醇的臨床應用及結核病免疫學的研究。1980年至1989年基礎科研恢復，每年發(fā)表論文幾十篇，結核體液免疫研究很熱門。1990年至1999年基礎科研穩(wěn)步發(fā)展，每年發(fā)表論文100～200篇，結核細胞免疫研究受重視，并開辟了全新的分子生物學研究領域。2000年之后我國才真正開始重視結核病基礎研究，基金投入增多，尤其是國家重大傳染病專項的支持，使結核病基礎研究進入繁榮時期；緊跟國際形勢，全面開花，碩果累累，論文逐年遞增，目前每年發(fā)表論文1000多篇。

由于結核病基礎研究內(nèi)容非常豐富，篇幅所限，難以面面俱到，筆者只是根據(jù)中文文獻試圖闡述我國在細菌學、免疫學、分子生物學、疫苗、新藥方面的主要研究和取得的重要進展，也試圖指出研究的前景和存在的問題。

細菌學研究

20世紀80年代之前，我國主要開展結核病細菌學方面的基礎研究，但進展緩慢。

一、非結核分枝桿菌的分離和鑒定

我國自1979年第四次全國結核病流行病學調(diào)查后，尤其是發(fā)生多起非結核分枝桿菌(NTM)暴發(fā)感染后，NTM感染引起重視。主要應用傳統(tǒng)方法從標本中分離、鑒定NTM，分離率南方高于北方，沿海高于內(nèi)地，常見的有20多種(如龜、鳥、胞內(nèi)、偶然分枝桿菌等)，大多數(shù)NTM分離株對多種抗結核藥物耐受[1]；從堪薩斯、龜和瘰疬分枝桿菌等中分離出質(zhì)粒，表明質(zhì)?？赡芙閷Я薔TM耐藥。20世紀80年代建立的NTM氣相色譜和高效液相色譜鑒定法由于儀器、試劑昂貴，操作需專業(yè)技術人員，而逐步被分子鑒定方法所代替。

二、結核分枝桿菌的變異

20世紀50年代結核分枝桿菌(Mtb)耐藥問題引起關注，發(fā)現(xiàn)耐藥Mtb毒力減弱[2]、超微結構和形態(tài)變化(1985年)、可能存在大分子量質(zhì)粒(1994年)，初步探索了Mtb的耐藥機制。耐藥表型的測定以傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)方法占主流，放射性方法被淘汰；21世紀初建立于非放射性快速培養(yǎng)系統(tǒng)上的藥敏試驗在臨床推廣應用，噬菌體生物擴增法及Mtb快速微量直視培養(yǎng)藥敏試驗方法未推廣應用，近年來分子藥敏試驗方法興起。1960年美國發(fā)現(xiàn)Mtb的L型變異株，揭示其細胞壁存在缺陷，是結核病遷延不愈、難治、復治的重要原因；1984年國內(nèi)誘導、培養(yǎng)出L型Mtb，解決了其培養(yǎng)困難的問題；2003年《中華結核和呼吸雜志》編輯委員會組織有關專家制定了《結核分枝桿菌L型的檢測方法(試行)》[3]，促進和規(guī)范了L型Mtb的檢測，但L型Mtb產(chǎn)生的機制尚需進一步的研究。1989年以來國內(nèi)許多地區(qū)發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療、新分離的Mtb中強、中等毒力株占90%以上，Mtb流行株的致病力、毒力引起關注。

三、細菌學檢查

標本中分枝桿菌檢查至今仍是結核病診斷的可靠依據(jù)，但臨床實際的陽性率并不高(15%～20%)，菌陰肺結核、肺外結核仍是臨床診斷的難題。20世紀50年代在直接涂片抗酸染色鏡檢法基礎上，建立了浮游集菌法、集菌法、厚涂片法、熒光法，提高了檢出率，部分方法沿用至今。2005年我國研發(fā)的夾層杯離心涂片集菌法快速查抗酸桿菌，提高了檢出率[4]；2010年引入的發(fā)光二極管(LED)熒光顯微鏡價格低廉，適用于基層[5]。20世紀50年代至今，我國對分枝桿菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法的研發(fā)從未停止過，土豆湯培養(yǎng)基等只在少數(shù)實驗室應用，近年來研發(fā)的變色培養(yǎng)基、雙相培養(yǎng)基比較簡便、價廉正在臨床推廣應用，但目前臨床廣泛應用的仍是改良羅氏雞卵培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基及引進的2種分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)。20世紀分枝桿菌復蘇生長促進因子(如Rv1009)的研發(fā)，有助于提高休眠Mtb的復蘇和培養(yǎng)陽性率[6]。由于分枝桿菌遺傳的固有特性，決定了依靠培養(yǎng)至肉眼可見細菌的時間不可能太短，需借助其他的技術快速、敏感地檢測細菌的存在。

結核病免疫學方面的研究

結核病既是細菌性疾病，也是一種免疫性疾病，20世紀80年代起結核病免疫機制的研究成為熱點,結核病免疫學飛躍發(fā)展。但Mtb感染后，機體的免疫應答很復雜，在感染的不同時期、不同個體也不盡相同，至今人們對于Mtb的致病機制和宿主的免疫保護機制還未完全搞清楚。

一、結核病體液免疫

抗結核抗體在抗結核免疫中也發(fā)揮著一定的作用，20世紀80年代以來IgG一直是研究和臨床檢測的主要抗體類型。2011年WHO不推薦將血清學檢測結果作為可疑肺結核或肺外結核的診斷依據(jù)(HIV感染除外)；盡管國內(nèi)開發(fā)的許多檢測試劑盒敏感度和特異度差異很大，但國內(nèi)研究的結果表明，抗體IgG對結核病尤其是肺外結核病和菌陰肺結核具有輔助診斷價值[7]。國內(nèi)外試劑盒在健康人群中均具有較高的特異性；假陽性主要出現(xiàn)在非結核呼吸疾病人群，關鍵在于Mtb抗原選擇的合理性、產(chǎn)品質(zhì)量的嚴格控制、實驗室的定期評估選擇。IgM是近期感染的標志，可用于感染早期的篩查，但在活動性結核病患者中陽性率低。IgA對于結核病的輔助診斷價值不大。IgE與肺結核的嚴重程度相關，IgE高水平表達的肺結核初治患者病情較嚴重，表現(xiàn)為痰菌陽性率高、肺空洞發(fā)生率高、輔助性T細胞(helper T cell，Th)2免疫增強、Th1和CD8+T淋巴細胞免疫反應嚴重削弱[8]。

在抗體檢測所用的抗原方面，20世紀80年代主要用結核菌素、PPD，特異性差；20世紀90年代采用純化的細胞壁糖脂或蛋白等天然抗原；21世紀初開始應用基因工程技術制備的重組蛋白[9]，解決了天然蛋白純化煩瑣、費時、得率低的難題，也提高了特異性；單一抗原逐步被多種抗原混合、融合或組合檢測所代替，提高了檢測的敏感度。在檢測方法方面，20世紀80年代采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)半定量檢測；20世紀90年代，金標免疫滲濾法和免疫層析法以其簡便、快速而在臨床廣泛應用；近年來化學發(fā)光技術的應用進一步提高了檢測的敏感度[10-11]。

分枝桿菌屬細菌具有許多共同的抗原，影響了診斷的特異性。20世紀80—90年代國內(nèi)熱衷于制備Mtb特異的單克隆抗體，用以檢測、鑒定Mtb抗原，對于結核分枝桿菌復合群(M.tuberculosis-complex，MtbC)的菌種鑒定、分型、抗原提純及結核病血清學診斷等都具有重要意義[12]。

由于Mtb抗原檢測可直接反映感染的存在，1980年以來一直孜孜不倦地探索Mtb在機體免疫系統(tǒng)作用下，免疫清除后產(chǎn)生的體液標本中的Mtb抗原、巨噬細胞或單個核細胞內(nèi)的Mtb抗原、血清中Mtb免疫復合物存在的診斷價值[11]。但應用ELISA方法檢測的敏感度和特異度各家報道高低不同，直至近年來快速檢測Mtb抗原MPT64的金標免疫層析試劑盒問世[13]，才應用于臨床，但敏感度還需進一步提高。

也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)結核病患者體液標本中一些酶類(如乳酸脫氫酶及其同功酶、溶菌酶、腺苷脫氨酶、膽堿酯酶、淀粉酶及其同工酶、丙酮酸激酶等)的表達水平顯著高于癌癥患者[11,14]，20世紀80年代腺苷脫氨酶常規(guī)用于臨床結核病的輔助診斷和鑒別診斷。

20世紀90年代開始關注活動性結核病患者體液免疫應答中高表達的一些與結核病患者病情程度呈正相關的多糖、多肽、糖蛋白(如α-1-酸性糖蛋白)、蛋白酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶-9)、蛋白生物素物質(zhì)等，研究其作為結核病活動性標志物的臨床意義[14-15]。

二、結核病細胞免疫

抗結核免疫主要是細胞免疫，20世紀90年代以后成為國內(nèi)研究的熱點。主要研究巨噬細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)和中性粒細胞(PMN)抗結核的作用機制、免疫調(diào)控機制，肺結核患者細胞免疫變化規(guī)律及其與結核病發(fā)病、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的關系，并探討其在結核病診斷、治療、預防中的作用。但國內(nèi)的研究不夠系統(tǒng)、不深入，淺嘗輒止。

通過對巨噬細胞功能的研究，部分闡明了Mtb感染后抵抗巨噬細胞吞噬、在胞內(nèi)的生存機制，不同毒力Mtb株感染誘導巨噬細胞產(chǎn)生不同水平的凋亡，誘導氮氧化物的產(chǎn)生、細胞因子分泌及對人巨噬細胞離子通道及其調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄表達的影響；ESX-1蛋白分泌系統(tǒng)與Mtb在巨噬細胞中存活、生長繁殖及致病密切相關，早期分泌靶抗原6(ESAT-6)在細胞內(nèi)可顯著增強巨噬細胞的吞噬功能，細胞內(nèi)低水平表達的ESAT-6還可以誘導巨噬細胞的凋亡[16]；肺結核患者肺組織中巨噬細胞和自然殺傷細胞的數(shù)量及分布；檢測巨噬細胞內(nèi)結核分枝桿菌DNA。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)在宿主的抗結核免疫應答中發(fā)揮重要作用，尤其是巨噬細胞和樹突狀細胞上的TLR2在免疫應答的早期階段識別肺結核Mtb抗原、介導巨噬細胞活化、啟動天然免疫。TLR介導的免疫調(diào)節(jié)信號通路受到多種蛋白[髓樣分化因子88(MyD88)、Toll樣受體相關的干擾素活化子(TRIF)、Toll樣受體相關分子(TRAM)]的精確調(diào)控, 活化核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)NF-κB信號通路，促進炎性細胞因子產(chǎn)生[17]。

結核病患者外周血Th1與Th2細胞亞群的變化規(guī)律對于病情監(jiān)控、療效判定和預后判斷都有重要意義。近年來發(fā)現(xiàn)一些新的T淋巴細胞亞群，形成新的免疫調(diào)控網(wǎng)絡，其中Th17是分泌白細胞介素17(interleukin 17,IL17)的CD4+T淋巴細胞亞群，Th17應答與結核分枝桿菌感染的轉(zhuǎn)歸及結核病病情的嚴重程度有關，活動性結核病患者Th17細胞應答受抑制[18]；MDR-TB患者外周血Th17細胞比例增加,IL-17水平升高。Th22和Th9分別是分泌IL22和IL9的CD4+T淋巴細胞亞群，上述各類T淋巴細胞亞群在結核性胸腔積液中顯著高于非結核性胸腔積液，治療后顯著降低，提示參與結核性胸膜炎的發(fā)生、發(fā)展，有助于結核性和癌性胸腔積液的鑒別。CD4+CD25+T淋巴細胞是調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cell,Treg)家族中最主要的一群，結核病患者CD4+CD25+Foxp3+[叉頭-翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead-winged helix transcription factor p3,Foxp3)]和CD4+CD25+CD127-Treg增多[18],通過抑制患者細胞免疫反應，參與結核病的發(fā)病。NK也參與抗結核免疫保護作用，初治肺結核患者外周血NK細胞數(shù)量明顯低于健康人，但NK細胞分泌IL-22、IL-17、干擾素(interferon,IFN)-α和IFN-γ的水平均明顯高于健康人。PMN抗Mtb感染的作用很少被關注，近年來發(fā)現(xiàn)PMN能使γδT細胞產(chǎn)生IFN-γ減少，但不影響IL17的產(chǎn)生。

結核病患者越來越多的細胞因子及其膜受體對細胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用及其抗結核生物學活性被研究，近年來發(fā)現(xiàn)干擾素誘導蛋白10(IP-10)、IL-9、IL-22等在結核病患者中的水平也顯著高于正常人或非結核性疾病患者[19]，檢測其在體液中的水平，具有輔助診斷價值，對抗結核療效和病情轉(zhuǎn)歸的評價具有一定的臨床意義。

細胞免疫檢測從方法、使用的抗原到產(chǎn)品的開發(fā)都取得顯著進步。皮膚試驗從20世紀50年代的舊結核菌素發(fā)展為1980年批準的卡介菌PPD[20]及1984年開發(fā)的人型PPD，使效價更穩(wěn)定。21世紀初開發(fā)的Mtb表達而卡介菌不表達的基因工程重組抗原如卡介菌RD1缺失區(qū)的ESAT6、CFP10已進入臨床試驗或中試,克服了PPD特異性差、尤其是卡介苗接種導致假陽性的缺點，這對普種卡介苗的國家是非常有益的。早期通過T淋巴細胞增殖試驗和雙抗體夾心ELISA法，近年來應用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)方法研究Mtb蛋白抗原刺激免疫細胞增殖、誘導產(chǎn)生細胞因子的水平[21]。IFN-γ釋放試驗(IGRA)作為一種新型的細胞免疫檢測技術用于臨床檢測，已開發(fā)出結核效應T細胞ELISPOT法和IFN-γELISA法兩類檢測試劑盒[21]，兩者并不完全一致，ELISPOT檢測的是分泌IFN-γ的效應T細胞，而ELISA檢測的是免疫細胞分泌的IFN-γ；而且前者不受患者外周血淋巴細胞數(shù)差異的影響，比后者更能客觀、準確地反映機體結核特異的免疫功能；前者需分離、計數(shù)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，避免個體差異，較適合于臨床輔助診斷;后者較簡單，適合于體檢、篩查；國外試劑盒應用多肽作為刺激抗原，而國內(nèi)試劑盒應用重組蛋白。盡管IGRA試驗不能鑒別結核潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)和活動性結核病，不能預測發(fā)展為活動性結核病的可能性，但對于臨床上菌陰肺結核和肺外結核病的輔助診斷、鑒別診斷還是發(fā)揮了重要的作用。20世紀90年代開始應用最先進的流式細胞術定量分析外周血或胸腔積液中免疫細胞表面抗原，對結核病的診斷、療效監(jiān)測、預后判斷也起了重要作用。

三、蛋白質(zhì)組學研究

2002年國內(nèi)開始Mtb蛋白質(zhì)組學的研究，近年來定量蛋白質(zhì)組學技術的發(fā)展相對定量地分析耐藥菌和敏感菌之間蛋白質(zhì)的差異表達，發(fā)現(xiàn)了一些差異蛋白，對Mtb蛋白質(zhì)的性質(zhì)、功能和相互關系進行鑒定，可作為新的抗結核靶位和耐藥結核病診斷的分子標志物[22]。研究感染后宿主免疫細胞蛋白質(zhì)表達的變化，了解了Mtb與宿主的相互作用，部分闡明了宿主抵御機制和Mtb致病機制。通過血清蛋白指紋圖譜的研究發(fā)現(xiàn)了一些診斷標志物，并建立了結核病血清診斷模型。

四、Mtb抗原的免疫學特性研究

21世紀初Mtb蛋白抗原免疫學特性的研究在國內(nèi)成為熱潮，應用基因工程技術陸續(xù)制備了100多個Mtb重組蛋白，如MPT64、ESAT6、CFP10、Ag85A、Ag85B，等等。宿主免疫細胞通過其表面受體識別蛋白質(zhì)抗原表位，近年來進一步關注與B細胞、T細胞(包括Th細胞、CD8+細胞毒性T 淋巴細胞等)和NK細胞免疫識別密切相關的抗原優(yōu)勢表位結構及其免疫機制[23]，為疫苗的發(fā)展、免疫診斷制劑的開發(fā)奠定了基礎。

五、LTBI的研究

潛伏(latency)、休眠(dormancy)和持留(persistence)從不同的角度詮釋了Mtb感染的狀態(tài)及固有的特性。LTBI是宿主感染Mtb后、沒有結核病臨床表現(xiàn)的一種帶菌狀態(tài)；休眠是指Mtb處于低代謝、停止生長的一種靜止狀態(tài)，休眠Mtb在體內(nèi)會不定期地復蘇、增殖，內(nèi)源性復燃導致發(fā)病或復發(fā)；持留是指Mtb在宿主體內(nèi)能夠長期生存的一種特性，它介導了宿主的潛伏感染和疾病的遷延不愈。2000年全國結核病流行病學抽樣調(diào)查結果顯示，Mtb感染率為44.5%。2007年以來LTBI成為研究的熱點，建立了IGRA診斷LTBI新方法，我國目前報道的LTBI感染率約為20%～30%。對LTBI人群免疫分子標識的篩選和驗證發(fā)現(xiàn)，低IFN-γ釋放水平的LTBI人群(LTB1)外周血CD4+T細胞全基因組表達譜接近于結核菌素試驗(TST)陰性的健康對照人群，與高表達IFN-γ的LTBI人群(LTB2)顯著不同；Th17相關基因RORc在LTB1和結核病患者人群明顯下調(diào)；與Th17形成相關的IL-6R信號通路上的IL6ST/gp130在LTB1組表達也明顯下調(diào)； Foxp3-Treg在LTB2和結核病患者組明顯下調(diào)；對Treg細胞生成有抑制作用的S1PR1在LTB1、LTB2和結核病患者中都明顯下調(diào)[24]。利用抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybridization, SSH)篩選到休眠Mtb和對數(shù)生長期Mtb的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)Mtb休眠期高表達的基因，為潛伏Mtb休眠機制的研究奠定了基礎。LTBI者全血中miR-29a-3p和miRNA144-3p的表達明顯高于活動性肺結核患者，可能成為診斷LTBI的標志物。已成功地建立了LTBI的體外及動物模型，發(fā)現(xiàn)異檸檬酸裂解酶(ICL) mRNA、Acr蛋白 mRNA 高表達可作為持留菌存在的標志，應用液體低氧培養(yǎng)并聯(lián)合 mRNA 檢測有可能檢測到Mtb持留菌。Mtb復蘇因子蛋白及噬菌體TM4對潛伏的Mtb有復蘇促進作用[6]。LTBI是結核病患者的重要來源，微卡菌苗能顯著提高LTBI人群固有和獲得性細胞免疫水平，對LTBI者發(fā)病可起預防性免疫治療作用，追蹤觀察4年，微卡治療組(0.30%，2/660)和化學治療組的結核病發(fā)病率(0.61%，4/660)明顯低于空白對照組(3.48%，23/660)，微卡的不良反應發(fā)生率明顯低于化學治療[25]，對LTBI人群開展預防性治療有可能成為今后一項重要的結核病控制措施。

結核分子生物學研究

自20世紀80年代末起，結核分子生物學的研究進展是最引人注目的，以基因工程技術的出現(xiàn)作為新的里程碑，標志著人類深入認識生命本質(zhì)并能動地改造生命的新時期開始。從Mtb的基因組DNA到轉(zhuǎn)錄組RNA，從其表達的蛋白質(zhì)到其代謝的產(chǎn)物，再到人體對其產(chǎn)生的免疫應答，結核分子生物學揭示了結核病發(fā)生、發(fā)展的分子機制，使我們從分子水平更好地了解Mtb的基因和遺傳本質(zhì)。Mtb全基因組的破譯、先進的分子生物技術的建立、分子靶位的闡明等研究成果，為Mtb致病機制、耐藥機制的闡明，快速、準確地診斷與鑒別診斷，有效藥物的研制，新疫苗的構建與設計奠定了理論基礎。

一、基因組學的研究

1998年Mtb H37Rv基因組破譯后，我國科學家對Mtb H37Ra和臨床流行的北京基因型菌株也進行了全基因組測序，了解了菌株的遺傳結構及北京基因型菌株的起源、進化和傳播歷史。Mtb H37Rv與H37Ra比較基因組學的研究，篩選到這兩種菌株間的差異基因，有助于尋找致病相關基因及特異性片段，可進行菌株分型，追蹤菌株來源；Mtb H37Ra與卡介菌基因組DNA小鼠皮內(nèi)接種后，均能誘導小鼠腹腔巨噬細胞活化并產(chǎn)生較強的抗結核免疫效應，兩者效果差異無統(tǒng)計學意義，同時鑒定了一些免疫保護基因[26]。

Mtb基因變異出現(xiàn)了多種具有不同毒力、傳染性、傳播性的Mtb菌株。1995年我國通過DNA指紋技術發(fā)現(xiàn)了北京基因型家族[27]，國內(nèi)也開展了一些Mtb毒力相關基因的研究，發(fā)現(xiàn)或證實一些基因如rv0494、ICL、pcaA和acr等與Mtb的感染、持留、增殖、播散密切相關，部分闡明了致病機制[28]。

二、耐藥分子機制的研究

1996年起國內(nèi)Mtb耐藥分子機制的研究成為熱點，藥物作用靶分子的改變是大部分Mtb耐藥產(chǎn)生的原因。國內(nèi)主要研究一、二線抗結核藥物耐受相關基因(如RNA聚合酶的β亞單位的編碼基因rpoB、過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG、烯?；€原酶編碼基因inhA、阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因embB、核糖體蛋白S12編碼基因rpsL、16S rRNA編碼基因rrs、吡嗪酰胺酶編碼基因pncA、DNA旋轉(zhuǎn)酶的A亞單位編碼基因gyrA、tlyA等)突變的位置、性質(zhì)、發(fā)生率及其臨床意義，發(fā)現(xiàn)Mtb耐多藥是各種藥物作用靶基因逐步突變累加所致[28]。氟喹諾酮類耐藥基因表達受Mtb五肽重復蛋白MfpA和MfpB調(diào)控。藥物外排泵也是Mtb耐藥的一種機制，目前已發(fā)現(xiàn)一些與Mtb耐藥相關的外排泵蛋白如Rv1747c等[29]。但Mtb耐藥機制尚未完全搞清楚，某些耐藥基因位點突變與耐藥表型之間的關系仍需進一步研究，以確定其臨床意義。

三、結核病易感性相關基因的研究

結核病具有家族聚集傾向，1995年起Mtb感染和發(fā)病的遺傳易感性研究在國內(nèi)成為熱點之一。目前，已發(fā)現(xiàn)了一些與結核病易感性相關的基因，如自然抵抗相關巨噬細胞蛋白1(nramp1)、人類白細胞抗原(HLA)、免疫調(diào)節(jié)激素維生素D受體(VDR)、甘露糖結合植物凝集素(MBL)、細胞因子(如IFN-γ、IL10、IL12β、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IL18，等等)、TLR等編碼基因，這些基因大多數(shù)與免疫系統(tǒng)和炎癥反應相關[28]。結核病易感通路是非常復雜的，雖然其易感性與某些基因多態(tài)性相關聯(lián)，但目前研究的候選基因較多，種族間存在差異，所用的方法、標準不統(tǒng)一，結論也不完全一致，也不系統(tǒng)。因此，目前尚不能提供令人信服的證據(jù)證明遺傳與結核病的相關性。在我國進一步開展大樣本量的比較研究，系統(tǒng)了解我國人群存在哪些抗性基因，哪些基因多態(tài)性對于患結核病的風險高，以便建立聯(lián)合檢測方法，早期發(fā)現(xiàn)結核病易感的高風險人群，早期干預或防護，降低結核病發(fā)病率。

四、抗結核藥物所致肝損傷易感相關基因的研究

抗結核藥物引起肝損傷是臨床上常見的不良反應，遺傳因素是肝損傷的危險因素之一。2004年國內(nèi)開始關注抗結核藥物代謝酶基因的多態(tài)性與肝損傷之間的關系，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種肝損傷易感相關基因，如N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)、細胞色素P450 2E1(CYP2E1)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、醌氧化還原酶(NQO1)、羧酸酯酶基因1(CES1)、尿苷葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)等，部分闡明了抗結核藥物引起肝損傷的分子機制[30]，但仍需深入研究藥物代謝酶在抗結核藥物性肝損傷(ATDILI)發(fā)生中的作用，在不同民族、不同區(qū)域、不同人群中采用統(tǒng)一ATDILI的診斷標準進行多中心、大樣本量的病例-對照研究和臨床驗證，篩選出ATDILI的分子標志物，建立ATDILI相關基因型的快速檢測方法，開發(fā)ATDILI發(fā)生的預警系統(tǒng)，以期在結核病患者化療前進行ATDILI風險預測，對高風險患者的肝功能進行密切監(jiān)測，為個體化護肝預防治療及制定化療方案提供科學依據(jù)。

五、分子流行病學的研究

1995年以來，國內(nèi)應用分子生物學技術分析Mtb臨床株的基因差異，研究結核病暴發(fā)流行、近期傳播、菌株分型、追蹤傳染源、內(nèi)源性復燃、外源性再感染、實驗室交叉污染等，確定中國Mtb具有明顯的基因多態(tài)性，且存在主要流行菌群，Mtb北京基因型菌株在中國呈較高水平的流行；但不同地區(qū)菌株具有不同的流行特點，如北京基因型菌株在上海地區(qū)有廣泛分布,但廣東地區(qū)成簇率和北京基因型所占比例均顯著低于其他地區(qū)；結核病患者中有部分是由于近期傳播而引起的[31-32]。但還需全面、準確地了解我國結核病發(fā)病情況、流行菌株，建立分子流行病學監(jiān)測體系，以闡明我國結核病的傳播流行規(guī)律，為制定切實有效的結核病防控措施提供科學依據(jù)。

目前，國內(nèi)常用的Mtb菌株基因分型方法主要有4種[33]：(1)1995年引入國內(nèi)的IS6110 DNA指紋圖譜分析方法，是基因分型的“金標準”，分辨率高，但操作繁瑣；(2)2001年建立的隨機擴增(RAPD)DNA指紋分型方法，操作簡便，但未標準化；(3)2003年引入國內(nèi)的間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法，簡便、快速，但分辨率低；(4)2004年建立的PCR-可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)分型方法和2005年建立的分枝桿菌散在分布重復單位(MIRU)分型方法，分辨率高、操作簡便、重復性好，可提供數(shù)字式的分型結果，易于分析、比較，但仍需進一步完善、標準化和規(guī)范化。

六、結核轉(zhuǎn)錄組學的研究

2003年始，國內(nèi)基因表達譜研究興起，為在轉(zhuǎn)錄組水平較全面地了解機體免疫功能的變化提供了可能。應用基因芯片技術研究Mtb臨床分離株感染人巨噬細胞后的表達變化，發(fā)現(xiàn)Mtb感染與其他細菌感染引起的免疫反應在轉(zhuǎn)錄水平具有共性，也有特性；研究結核病患者體內(nèi)免疫相關基因的差異表達，揭示多個免疫相關基因的差異變化顯著；研究肺結核患者和健康人群PBMC基因表達譜差異, 發(fā)現(xiàn)差異基因大部分位于細胞內(nèi)，起連接功能，具有酶催化活性，在代謝中起著重要作用，并主要位于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號通路和趨化因子信號通路中[34]。

近年來非編碼的小分子RNA(microRNA或miRNA)的作用受到重視，通過對肺結核患者和健康對照者的PBMC miRNA表達譜或循環(huán)miRNA水平的比較分析，發(fā)現(xiàn)活動性肺結核患者miRNA及其靶基因表達異常，有些miRNA表達上調(diào)如miR-144*，有些miRNA表達下調(diào)，并對這些異常表達的miRNA在人類染色體基因組上進行了定位[35]，揭示miRNA參與Mtb的致病機制，在Mtb和宿主的相互作用中起重要作用，在人抗結核免疫反應中起調(diào)節(jié)作用；但對這些miRNA的功能了解較少，大多數(shù)尚不清楚，盡管通過不同計算方法預測了許多參與不同信號通路的靶基因，但只有少數(shù)預測的靶基因被證實。

七、結核代謝組學的研究

代謝組學是1999年新興的“組學”，在藥物毒理學研究中有著廣泛的應用前景。國內(nèi)2005年才聚焦結核代謝組學研究領域，通過研究異煙肼、利福平灌胃后不同時段大鼠尿液的代謝表型改變，及其與組織病理學和血漿生化指標變化的相關性，發(fā)現(xiàn)大鼠尿液基于高頻氫質(zhì)子磁共振波譜(1H-MRS)的代謝軌跡與異煙肼、利福平毒性作用時間密切相關，異煙肼、利福平引起的肝毒性與線粒體功能受損、三羧酸循環(huán)中能量代謝異常及葡萄糖代謝紊亂有關[36]。應用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(GC-MS)分析結核性腦膜炎患者腦脊液中代謝組學的變化，發(fā)現(xiàn)其糖、脂肪酸及氨基酸代謝均發(fā)生改變，有的代謝物(如L-蘇氨酸、來蘇糖等)表達下調(diào)，有的代謝物(如山梨醇)表達上調(diào)，可能作為診斷的分子標志物[37]。結核代謝組學研究只是初步的，尚需進一步研究。

八、基因診斷

基因診斷是基因工程在醫(yī)學領域迅速發(fā)展的一個重要體現(xiàn)，許多分子生物學新技術不斷涌現(xiàn)，以其快速、敏感、特異的優(yōu)勢在臨床應用，使結核病的診斷水平上了一個新臺階。

20世紀80年代末，Mtb DNA探針的研究拉開了我國結核病基因診斷的序幕，一系列非核素標記方法及不同的雜交方法的建立為DNA探針的開發(fā)應用奠定了堅實的基礎。20世紀90年代初，聚合酶鏈反應(PCR)技術的建立顯著提高了檢測的敏感度，而在臨床較廣泛地得到應用。特異的DNA探針與敏感的基因擴增優(yōu)勢結合衍生出許多新的基因診斷技術；20世紀90年代末，熒光定量PCR實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍；2005年應用逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測活Mtb中的mRNA可監(jiān)測化療效果；近年來恒溫擴增試劑盒[恒溫擴增-防污染核酸試紙條、DNA環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)]開發(fā)成功，不需要特殊的儀器設備，使基層醫(yī)療機構也能享受到高科技發(fā)展的恩惠[28,38]。建立于基因擴增技術基礎之上的基因突變檢測技術,誕生了新的分枝桿菌分子菌種鑒定技術和Mtb分子藥敏試驗方法(直接測序法、線性探針、基因芯片法等)，使臨床“結核病”的籠統(tǒng)診斷進一步細化到分枝桿菌菌種和耐藥結核病成為可能[28]。

結核病疫苗的研發(fā)

1921年法國巴斯德研究所的Calmette和Guérin研制成功牛分枝桿菌減毒活疫苗——卡介苗(BCG)，1933年留法科學家王良從法國引進卡介苗在重慶生產(chǎn)；1937年劉永純開始在上海巴斯德研究院生產(chǎn)BCG；1948年陳正仁、魏錫華、朱宗堯從丹麥血清疫苗研究所引進丹麥亞株823在北京生產(chǎn)。1978年卡介苗接種納入兒童計劃免疫，但并不能預防肺結核的發(fā)生，而且人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)的感染可能導致卡介菌在體內(nèi)播散，結核病新疫苗的研發(fā)迫在眉睫。我國結核病治療性滅活疫苗陸續(xù)研發(fā)成功，如1998年母牛分枝桿菌菌苗(微卡菌苗)及從德國引進國內(nèi)生產(chǎn)的草分枝桿菌制劑(烏體林斯)、2000年卡介苗多糖核酸注射液(斯奇康)用于臨床輔助結核病化療，2006年研發(fā)的無細胞恥垢分枝桿菌疫苗正在進行臨床試驗。為了克服滅活疫苗只能誘導短暫的體液免疫和Th1型細胞免疫應答，不能誘導特異性CTL免疫應答的缺點，國內(nèi)新型結核病預防性、治療性疫苗的研究層出不窮。如2001年首次出現(xiàn)的結核DNA疫苗、重組卡介苗，2007年結核重組腺病毒疫苗，2008年結核重組恥垢分枝桿菌菌苗、亞單位疫苗，2009年結核重組母牛分枝桿菌菌苗和2011年重組痘苗病毒疫苗，均表達不同的Mtb增殖期、潛伏期保護性抗原或(和)人類細胞因子，篩選、比較其免疫原性、保護效力或治療效果，目前部分疫苗在中試，沒有進入臨床試驗，落后于國外的研究。2012年報道的卡介菌CpG DNA復合佐劑-02系統(tǒng)為結核亞單位疫苗提供了有效的佐劑。結核病新疫苗的研發(fā)方興未艾，相信不久的將來新型結核病治療性疫苗或加強型疫苗將問世，但替代卡介苗的新型結核預防性疫苗仍任重而道遠[39]。

抗結核新藥的研發(fā)

一、先導化合物和化學藥物的研究

1944年第一個有效抗結核藥物鏈霉素的問世，標志著結核病治療進入了有效化療時代，使結核病的控制有了劃時代的改變，全球結核病疫情迅速下降。我國目前常用的一、二線抗結核化學藥物的研制主要是跟著國外的腳步，晚幾年問世。也通過化合物篩選、新藥設計合成及對現(xiàn)有藥物的再修飾等途徑，發(fā)現(xiàn)了一些有潛力的具有抗結核或分枝桿菌活性的先導化合物如多巴胺[40]，并研究了其藥物作用靶位和作用機制，其中許多都值得從化學和生物學的角度進一步開發(fā)成新藥，但只有少數(shù)自主研發(fā)的新藥獲得成功。如1975年上海醫(yī)藥工業(yè)研究院研制的青紫霉素，1976年四川抗菌素工業(yè)研究所在利福平基礎上研制的利福定(異丁基哌嗪力復霉素)。經(jīng)纖維支氣管鏡介入治療空洞型肺結核或耐多藥肺結核的介入用制劑目前多為口服或靜脈藥物溶解于真溶液或混懸于凝膠中配制而成，滯留效果差，凝膠基質(zhì)不能吸收；近年來研究緩釋給藥系統(tǒng)，如環(huán)丙沙星殼聚糖緩釋微球，動物實驗顯示有較好的組織相容性、留滯性、黏附性、安全性，自身可降解[41]，尚需進一步進行臨床實驗證明其安全性和有效性。20世紀80年代開始關注抗結核藥物之間的相互作用，同時研究抗結核藥物血漿、尿液中藥物濃度、藥物的代謝及藥物的生物利用度[42]，為聯(lián)合用藥、合理用藥奠定了基礎。

二、中藥抗結核有效成分及中藥有效方劑的研究

中醫(yī)藥是中華民族的醫(yī)學瑰寶，中醫(yī)藥治療結核病已有1000多年的歷史，具有抑制殺滅Mtb、緩解化療藥物的不良反應、有效緩解結核中毒癥狀、增強機體免疫力、降低耐藥結核病的發(fā)生率的優(yōu)點。20世紀50年代至今，我國結核病防治工作者一直孜孜不倦地挖掘、探索，取得了一些進展。對曾經(jīng)用于治療結核病的近千種中藥的作用及其有效成分進行研究，發(fā)現(xiàn)了許多中藥及其成分對Mtb的生長具有抑制作用，如魚腥草、艾葉、百部等；還有許多中藥及其成分通過提高機體免疫力發(fā)揮抗結核作用，如黃芪多糖、靈芝等[43]。開發(fā)了許多中成藥制劑用以輔助結核病化療，如治療頸淋巴結核的結核膏，治療肺結核的結核丸、抗癆丸、肺泰膠囊、芪貝膠囊等，但由于其見效慢、抑菌作用不強、易復發(fā)、需辯證施治而未被重視，未在臨床廣泛應用。我國抗結核中醫(yī)藥的研究、應用進展緩慢，主要存在下列問題：(1)研究不夠深入，大多數(shù)只是對天然藥物的粗提取物進行研究，很少深入研究中藥的主要活性成分，對其作用機制的研究更少。(2)缺乏綜合評價，大多數(shù)研究只是評價中藥對Mtb的抑菌或者殺菌作用，較少研究中藥免疫作用對抗結核療效的影響、中藥對化療藥物的協(xié)同作用，等等。(3)傳統(tǒng)的中醫(yī)理論體系未能有效的傳承，中醫(yī)藥成為西藥的補充。因此，若中醫(yī)、西醫(yī)兩大理論體系進行有機結合、共同發(fā)展，有望成為結核病脫困的一個有效路徑。

展 望

人類對結核病的認識和研究是一個逐步發(fā)展的過程，上述一系列的研究成就使人類受益匪淺。但至今在傳染源的發(fā)現(xiàn)、結核病的治療和預防三大環(huán)節(jié)上仍有許多問題亟待解決。因此，基礎科研圍繞著人體與Mtb斗爭的方方面面開展全方位的研究，從Mtb的基因組DNA到轉(zhuǎn)錄組RNA，從其表達的蛋白質(zhì)到其代謝的產(chǎn)物，再到Mtb對人體的致病作用及人體對其產(chǎn)生的免疫應答，希望尋找出干預的措施、控制的手段。

建國65年來，我國的基礎研究比較薄弱，主要開展應用基礎研究和應用研究，原始創(chuàng)新的研究少，大多數(shù)研究是跟著國外或其他學科研究的腳步走，引進、吸收、再創(chuàng)新。中國的結核病基礎研究從細菌學研究、抗結核藥物的仿制、中藥的開發(fā)起步，到免疫學的發(fā)展、分子生物學的興盛，碩果累累，使我國結核病的診、防、治水平取得了長足的進步，新的免疫和基因檢測技術使菌陰結核病、耐藥結核病、分枝桿菌病的診斷不再束手無策，“組學”診斷也向臨床伸出了橄欖枝；在化學藥物的研發(fā)曠日持久、進展緩慢之時，治療性疫苗和中醫(yī)藥的開發(fā)為結核病的輔助治療提供了新武器，對于難治性結核病也不失為一條脫困的路徑；我國的結核病防控策略重點放在“病”上，即發(fā)病后的診斷和治療，而對于“防”重視不夠，也缺乏有效的手段，應用治療性疫苗預防治療LTBI高危人群將是一個經(jīng)濟、可接受的控制策略，哨點前移，由治“已病”到防“未病”；卡介苗加強型疫苗接踵而至，新的預防接種策略在向我們招手，健康人群的保護將不再是鏡花水月。在基礎研究的科技支撐下，我們期待著我國的結核病疫情得到持續(xù)的大幅度下降。

隨著生物醫(yī)學研究新技術體系的建立與交叉融合，結核病的基礎研究面臨著機遇和挑戰(zhàn)，我們?nèi)孕柙诨蚪M水平上深入研究其生命信息及其功能，認識其核酸、蛋白質(zhì)組成的許多基本規(guī)律，徹底搞清楚這些基因產(chǎn)物的功能、調(diào)控、基因間的相互關系和協(xié)調(diào)，深入研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與其他生物大分子之間的相互作用和作用方式，以進一步揭示Mtb的致病機制、耐藥機制，闡明人類對Mtb的免疫清除機制，發(fā)現(xiàn)新的抗結核靶標和結核病診斷的分子標志物，為研制新型診斷試劑、抗結核藥物和結核病新疫苗奠定基礎。

長風破浪會有時，直掛云帆濟滄海！

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