我國結核病實驗室診斷進展歷程

宋媛媛 鄭惠文 趙雁林

結核病是一種古老的疾病，在人類歷史上肆虐了數千年，已經造成包括雪萊、契訶夫和諸葛亮等在內的數以千萬計甚至是無以計數的人死亡，一度曾被稱為“白色瘟疫”。從伏曦畫八卦，制九針。神農嘗百草，始有醫藥。黃帝教民治百病，埃及、希臘神話，荷馬史詩等中的醫學史里可以看到，人類一直在同疾病做斗爭，人類的醫學史也是人類同疾病做斗爭的歷史，在業內人士的共同努力下，結核病實驗室診斷技術也伴隨著人類抗擊結核病工作的全面展開和深入而不斷發展和涌現。

實驗室診斷是結核病診斷、治療及預防控制過程中所必需的。結核病實驗室檢查是發現傳染源的最主要手段，是確診結核病和選擇治療方案的主要依據，也是考核療效、評價防治效果的可靠標準。結核病實驗室工作是全國結核病防治規劃(NTP)的重要組成部分，在結核病防治工作中起著不可缺少的重要作用。筆者就我國結核病實驗室診斷技術的發展歷程和應用闡述如下。

結核病實驗室網絡的建立

解放初期，我國主要通過建立結核病療養院和傳染病醫院等來收治結核病患者，我國于1981年建立了結核病登記報告制度；1991年和1992年相繼開展世界銀行貸款結核病控制項目和中央加強與促進結核病項目，標志著我國開始開展系統的結核病防治工作，當時的實驗室診斷技術主要以涂片為主，隨著結核病防治項目的不斷擴展，涂片檢查實驗室(痰檢室)逐步在國內建立，1994年開始創建痰涂片質量控制系統，到2000年已初步具備全國實驗室網絡規模，質控覆蓋面和力度逐年增加[1]。

2001—2004年，全國結核病防治機構已逐步建立了獨立的結核病實驗室，我國進一步健全了“國家級參比實驗室→省級參比實驗室→地(市)級實驗室→縣級實驗室”四級結核病細菌學實驗室網絡。2004年制定《中國結核病防治規劃——痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》，并快速覆蓋到各級實驗室。2004年前國家衛生部統一部署在全國1/3的鄉鎮衛生院設立了痰涂片檢查點，至2005年底共設立了9520個鄉鎮查痰點；從2008年起，我國開展培養、藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)和分子生物學診斷的結核病實驗室逐年增多，根據《全國結核病防治規劃(2011—2015年)》的要求，到2015年底，將有80%縣級結核病實驗室具備開展分枝桿菌培養的能力，100%的地市級結核病實驗室具備藥敏試驗的能力，100%的省級結核病實驗室具備開展快速菌種鑒定的能力；我國結核病實驗室網絡工作模式主要是國家級、省級、地(市)級實驗室分別負責對其下級實驗室進行質量控制、技術指導和培訓等技術管理工作。

結核分枝桿菌培養和藥敏試驗

新中國成立后的很長一段時期，在我國，以影像學檢查作為發現結核病的主要手段，1951年孟昭赫撰寫了《結核病細菌學診斷法》，以1953年林建撰文詳細描述Mtb的細菌學檢查為標志，我國開始使用集菌涂片法和痰分枝桿菌培養方法；1955年朱貴卿等引進并改良了玻片培養法，鄭志平等用谷氨酸鈉替代天門冬酰胺制備分離培養基，隨后該培養基成為我國臨床分離培養的主導培養基一直沿用至今。1993年我國開始引入液體培養BACTEC TB 460快速檢測系統，該方法采用放射性核素技術對細菌在生長過程中產生的具有放射性的代謝產物14CO2含量進行監測，但因該底物有放射性，易污染環境，我國于1998年停止了該設備的使用；同年在我國引入MGIT 960系統即分枝桿菌生長指示管(mycobacteria growth indicator tube，MGIT) 960系統，該方法是集分枝桿菌快速生長培養、檢測及藥敏試驗技術為一體的全自動分枝桿菌培養系統，解決了BACTEC TB 460存在的放射性污染問題，并保留了其快速的優點，使結核病細菌學檢查方法有了進一步發展。1995年，國家結核病參比實驗室與WHO積極合作，組織開展全國耐藥監測項目，自此引入了比例法藥敏試驗，我國開始了絕對濃度法和比例法藥敏試驗的并用時代。

目前，常用的自動化液體培養系統主要有3種：(1) BACTEC MGIT 960自動化培養系統，通過檢測液體培養基中消耗氧氣的量來確定是否有細菌生長，MGIT培養管底部的硅樹脂中含有氧淬滅熒光劑，當細菌生長過程中吸收散布在培養管中的氧氣，排放出CO2，隨著管中氧氣的逐漸損耗，熒光劑不再被抑制，當使用紫外線(ultra-violet ray，UV)進行觀察時，MGIT培養管便會發出熒光，其熒光強度直接與氧氣的消耗呈正相關，對于Mtb來說，在陽性情況下，每毫升培養基中大約有105～106個菌落形成單位(CFU)，如果6周(42 d)之后，該儀器仍為陰性，則表示培養管為陰性[2-7]；(2)BacT/ALERT 3D培養系統，通過連續檢測接種標本的培養瓶中CO2水平及其變化判斷是否有分枝桿菌生長，培養瓶底部含有顏色感應器，此系統用一個比色計傳感器和反射光監測溶解于培養基內的CO2的存在和生成，當培養瓶中有微生物生長將產生CO2，導致培養基的pH 值改變，傳感器顏色從藍綠色變為黃色，儀器每10 min自動連續地檢測，如有顏色改變將自動報警[8]；(3)Versa TREK/ESP全自動快速血培養系統，通過自動監視培養基瓶子頂部的氧氣消耗量來查看Mtb的生長，儀器通過壓力感應器感應培養瓶內的壓力變化，從而判斷是否有細菌生長。

分子診斷方法

20世紀90年代初，國內眾多實驗室開始使用聚合酶鏈反應(PCR)技術，至1997年由于污染防控措施不到位，曾經一度在結核病的實驗室輔助診斷中停止使用；之后，經過加強質量管理等措施又逐步應用到臨床檢測中。21世紀初始，隨著分子生物學技術的不斷發展，新型分子診斷技術大量涌現，因其通常具有較高的敏感度、特異度而日益顯示其優越性，近年來在我國食品藥品監督管理總局獲批準注冊的分枝桿菌快速分子診斷技術主要有：實時熒光定量聚合酶鏈式反應法、核酸探針技術、基因芯片(genechip)技術、環介導等溫擴增技術、交叉引物擴增技術(crossing priming amplification, CPA)和熔解曲線等檢測技術產品。

實時熒光PCR熔解曲線法，是建立在野生型DNA分子和突變型DNA分子的GC含量不同的基礎之上，在PCR體系中加入兩端分別標記有熒光基團與淬滅基團的探針，在PCR過程中擴增處與探針序列互補的單鏈核苷酸序列，在擴增完成后增加熔解曲線分析過程，同時實時監測熒光值的變化，通過計算熒光值與溫度的負導數，可獲得探針與該序列雜交產物的熔解曲線，并得出熔點(Tm值)，根據推斷該序列突變信息，從而檢測Mtb是否對利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇和氟喹諾酮類等藥物耐藥，我國正在對其可靠性和可行性進行多中心臨床評估[9-10]。

基因芯片也叫DNA芯片、DNA微陣列、寡核苷酸陣列，是指采用原位合成(或顯微打印手段)，將DNA探針固化于支持物表面上，產生二維DNA探針陣列，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號來實現對生物樣品快速、并行、高效地檢測。基因芯片對結核病的耐藥檢測基于Mtb針對不同藥物的基因突變位點不同，各突變位點與耐藥性有一定的相關性，通過檢測突變位點的DNA片段，來判定Mtb是否對利福平和異煙肼耐藥[11-12]，該方法經過多中心評估，已經在我國一些地區推廣應用。

線性探針技術通過將PCR擴增、反向雜交、膜顯色技術合為一體，通過引物擴增目的片段，擴增產物與膜上固定的特異性探針雜交，雜交物通過酶顯色反應判斷結果。線性探針檢測Mtb耐藥基于Mtb針對不同藥物的基因突變位點不同，各突變位點與耐藥性有一定的相關性，通過檢測出突變位點的DNA片段，來判定Mtb是否對利福平和異煙肼耐藥[13-14]，該方法經過多中心評估，已經在一些地區推廣應用。

CPA是一種新的核酸恒溫擴增技術。CPA與其他技術相結合(如快速核酸提取技術、核酸試紙條檢測技術等)，除包含具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶外，還主要包括擴增引物和兩條交叉引物。這些寡聚核苷酸鏈能依靠嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus，Bst)DNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使DNA的循環擴增能不斷的實現，從而確定受檢樣本中是否有Mtb的存在[15-16]。多中心臨床驗證顯示，其敏感度和特異度與傳統培養方法相近[17]。

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(simulta-neous amplification test，SAT)是將核酸恒溫擴增和實時熒光檢測相結合的一種新型核酸檢測技術，在同一溫度下，首先通過莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，M-MLV)反轉錄酶產生靶標核酸(RNA)的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產生多個(100～1000個)RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合，產生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環情況[18-19]。

環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是針對靶基因序列的不同區域設計幾種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65 ℃左右)即可完成核酸擴增反應的特點，對Mtb目的DNA片段進行檢測從而獲得結核病信息的方法[20-21]。

半巢式全自動實時熒光定量PCR檢測系統(Xpert Mtb/RIF)是一種半巢式實時熒光PCR體外診斷技術，可對Mtb及其對利福平耐藥性進行檢測，該技術針對rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區間(RRDR)設計引物、探針，檢測其是否發生突變，進而用于診斷患者是否罹患結核病及是否對利福平耐藥(rpoB序列存在突變)，該方法整合了基于定量PCR 分子遺傳檢測所需的3個步驟(樣品準備、擴增、檢測)，將待檢樣品放入到Xpert的反應盒中，系統將會自動按照相應的程序運行，實時監測PCR進行情況[22-24]。該方法經過多中心評估，已經在我國一些地區使用。

熒光定量PCR是利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化、并通過循環閾值(Ct值)和標準曲線的分析對起始模板進行定量檢測的方法。該方法實現了對PCR指數增長期的閉管信號檢測，不但檢測敏感度高、污染概率小，且可對初始模板進行相對或絕對的定量，避免了傳統PCR主要針對線性增長期或平臺期檢測的種種缺陷。依據檢測方式的不同，熒光定量PCR可大體分為熔解曲線分析和熒光化學檢測兩種，在Mtb檢測試劑盒中常見的TaqMan探針、分子信標和雜交雙探針等均屬于后者。熒光定量PCR檢測的靶序列通常為16S rDNA、16S rRNA和23S rRNA間的內轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)，僅存在于結核分枝桿菌復合群(MtbC)的插入序列IS6110，以及相對分子質量為65 000的熱休克蛋白基因、recA基因、sodA基因、hsp65基因和rpoB基因等，主要檢測MtbC的存在與否。由于目前認為MtbC由Mtb、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、肯尼迪分枝桿菌(M.canettii)、山羊分枝桿菌(M.caprae)和pinnipedii分枝桿菌7種菌種組成，我國除Mtb和牛分枝桿菌外其余菌種較罕見，而MtbC各成員間的DNA序列高度相似，具有共同的核心基因組，較難加以區分，故在臨床檢測中一般僅檢測MtbC存在與否即可。進一步的鑒定可檢測pncA和oxyR基因的突變、PCR擴增缺失區(region of deletion，RD)或mpt40-PCR等，可部分區分MtbC菌種。而綜合23S rDNA、gyrB基因和RD1側翼區域的檢測結果可鑒定大部分MtbC菌種，少數菌種需要全基因組序列分析方可區分[25-26]。

免疫學診斷技術

1890年Robert Koch制備了舊結核菌素，開創了結核病免疫學診斷的先河。1953年我國張學德等評估了敏感紅細胞凝集試驗；“文革”之后直到1980年，酶聯免疫試驗和單克隆技術逐步在我國建立和使用，目前常用的檢測方法主要有酶聯免疫吸附試驗、斑點免疫滲濾試驗、斑點免疫層析試驗、免疫印跡試驗、細胞因子檢測和蛋白芯片技術等。

2003年起，我國各級實驗室陸續開始應用γ干擾素(IFN-γ)釋放試驗來確定結核潛伏感染(LTBI)者及結核病的輔助診斷。其中常用的方法有兩種。(1)基于全血的酶聯免疫吸附試驗。通過應用Mtb特異性蛋白質的多肽抗原[這些蛋白質是早期分泌性抗原靶6 (ESAT-6)、培養濾液蛋白10(CFP-10)和TB7.7]與全血共孵育，由于BCG菌株及絕大部分的非結核分枝桿菌(M.kansasii、M.szulgai及M.marrinums除外)都不含有這3種蛋白質，它們能夠刺激感染Mtb者的T細胞產生IFN-γ的反應，但在未感染者、或接種卡介苗但無結核病或LTBI風險者，則不會產生反應，利用酶聯免疫實驗檢測并定量分析IFN-γ的濃度，判斷是否存在Mtb特異性細胞免疫反應[27-28]。(2)基于外周血淋巴細胞的免疫斑點試驗。通過將外周血淋巴細胞、Mtb特異的混合抗原A和B(分別為ESAT-6和CFP-10的部分多肽片段)，與對照試劑一起加入預先包被抗IFN-γ抗體的微孔培養板進行培養。當外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中存在對Mtb的特異T細胞時，培養液中加入的Mtb特異混合抗原A和B時將刺激其分泌IFN-γ。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ抗體捕獲，再次加入堿性磷酸酶標記并針對不同IFN-γ表位的二抗與被捕獲IFN-γ結合，滯留在微孔板表面，顯色底物在反應部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑點。每個斑點代表1個Mtb特異的效應T細胞。根據斑點數可以推測體內是否存在對Mtb反應的效應T細胞[29]。

從全球來看，結核病的高負擔國家主要集中在發展中國家。由于經濟發展程度所限，已經被使用了百余年的痰涂片顯微鏡檢查技術和分離培養技術仍然是發展中國家結核病實驗室診斷體系中所采用的主要方法。我國是發展中國家，結核病控制系統中目前奉行著以細菌學檢查作為發現傳染源和療效評定的主要手段，逐步推廣和應用新型實驗室診斷技術的態勢。目前，我國的結核病實驗室網絡中，已經有1/3的縣(區)至少有一家結核病實驗室配備了快速分子診斷技術；全國2/3的地(市)級中至少有一家結核病實驗室裝備了快速進行Mtb耐藥檢測的分子診斷設備；全國幾乎100%的省級結核病實驗室具備了快速分子菌種鑒定的能力。除此之外，通過分析分枝桿菌的生物標志，從而確定其基因型，進而分析Mtb在人群中的流行變異趨勢和分布情況的基因分型技術在各省已經被廣泛使用，常用的基因分型方法主要有：IS6110-限制性酶切片段長度多態性分析(IS6110-RFLP)、可變數量串聯重復序列(variable number tandem repeat，VNTR)分析、分枝桿菌散在分布重復單位(Mycobacterial interpersed repetitive units，MIRU)分型、間隔區寡核苷酸分型(spoligotyping)、單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析、長片段多態性分析(large sequence polymorphism，LSP)，以及缺失圖譜等方法。基因分型技術可以在一定條件下追溯和確定傳染源，鑒別未知傳播，發現和鑒別培養的假陽性。對于Mtb基因分型來講，目前可以選擇的手段較多，技術也比較成熟，如何對基因分型結果進行詮釋是其關鍵所在。

小 結

我國結核病實驗室診斷體系已經建立多年，總體上由三部分組成。第一，國家、省、地(市)和區(縣)的疾控機構結核病實驗室體系，這個網絡中的地(市)級、區(縣)級結核病實驗室，當前以細菌學檢查為主要技術手段，全國1/3的區(縣)級實驗室配備了分子診斷設備，2/3以上的地(市)級實驗室具備開展快速藥敏試驗和分子生物學菌種鑒定的能力。第二，結核病定點醫院和專科醫院結核病實驗室，絕大多數可以開展涂片鏡檢、分離培養和藥敏試驗等較為全面的細菌學檢查工作，也能夠采用快速培養方法和分子生物學技術對于一些特殊患者進行鑒別診斷。第三，綜合醫療機構的結核病實驗室，可以開展細菌學檢查和一些新的實驗室診斷方法。目前，在所有上述實驗室中，涂片顯微鏡檢查的質量控制體系主要在結核病防治系統內得到了規范和標準化，醫療機構檢驗科的結核病實驗室正在逐步加入質控體系和走向進一步規范化的進程中，傳統藥敏試驗和分子診斷技術的質量保證體系以及能力驗證工作正在全國按計劃逐步擴展，預計在2015年底前將全面覆蓋。

[1]趙雁林, 尚美. 我國結核病實驗室診斷的現狀. 中華檢驗醫學雜志, 2007, 30(7): 725-728.

[2]European Centre for Disease Prevention and Control. Mas-tering the basic of TB control: development of a handbook on TB diagnostic methods. Stockholm: European Centre for Di-sease Prevention and Control, 2011.

[3]Murray PR. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Wa-shington: American Society for Microbiology Press, 2007.

[4]Use of Liquid TB Culture and Drug Susceptibility Testing(DST) in Low and Medium Income Settings//World Health Organization. Summary report of the Expert Group Meeting on the use of liquid culture media. Geneva: World Health Organization, 2007.

[5]World Health Organization. Framework for implementing new tuberculosis diagnostics. Geneva: World Health Organization, 2010.

[6]World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part Ⅲ Culture. WHO/TB/98.258.Geneva: World Health Organization, 1998.

[7]World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part Ⅰ organization and management. WHO/TB/98.258. Geneva: World Health Organization, 1998.

[8]Thorpa TC, Wilson ML, Tumer JE, et al. BacT/Alert:an automated colorimetric microbial detection system. J Clin Microbiol,1990, 28(7):1608-1612.

[9]Huang Q, Liu Z, Liao Y, et al. Multiplex fluorescence mel-ting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS One, 2011, 6(4): e19206.

[10]胡思玉, 牛建軍, 權勝卯, 等. 探針熔解分析法檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥突變的應用和評價. 中華檢驗醫學雜志, 2011, 34(10): 935-939.

[11]Pang Y, Xia H, Zhang Z, et al. Multicenter evaluation of genechip for detection of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol, 2013, 51(6): 1707-1713.

[12]周楊, 歐喜超, 樂軍, 等. 基因芯片診斷耐多藥結核病的臨床多中心研究. 中華檢驗醫學雜志, 2011, 34(9): 793-799.

[13]Ling DI, Zwerling AA, Pai M. GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analy-sis. Eur Respir J, 2008, 32(5): 1165-1174.

[14]李強, 歐喜超, 夏輝, 等. Genotype MTBDRplus 快速耐藥診斷方法在地市級結核病醫院應用的評估研究. 中國預防醫學雜志, 2013,14(1): 35-38.

[15]Fang R, Li X, Hu L, et al. Cross-priming amplification for rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisin sputum specimens. J Clin Microbiol, 2009,47(3): 845-847.

[16]Ou X, Song Y, Zhao B, et al. A multicenter study of cross-priming amplification for tuberculosis diagnosis at peripheral level in China. Tuberculosis (Edinb), 2014,94(4):428-433.

[17]周靜宇, 徐生梅. 交叉引物擴增技術快速檢測結核分枝桿菌. 臨床檢驗雜志, 2010,28(1): 22.

[18]倪麗麗, 羅柳林, 景玲杰, 等. 恒溫擴增實時熒光檢測技術在肺結核診斷中的臨床價值. 中華檢驗醫學雜志, 2012, 35(8): 702-705.

[19]崔振玲, 沙巍, 黃曉辰, 等. RNA 恒溫擴增技術快速檢測痰標本中結核分枝桿菌的研究. 中華結核和呼吸雜志, 2012, 34(12): 894-897.

[20]Mori Y, Kanda H, Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): recent progress in research and development. J Infect Chemother, 2013, 19(3):404-411.

[21]Ou X, Li Q, Xia H, et al. Diagnostic accuracy of the PURE-LAMP test for pulmonary tuberculosis at the county-level laboratory in China. PLoS One, 2014, 9(5):e94544.

[22]Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med, 2010, 363(11): 1005-1015.

[23]Van Rie A, Page-Shipp L, Scott L, et al. Xpert?MTB/RIF for point-of-care diagnosis of TB in high-HIV burden, resource-limited countries: hype or hope. Expert Rev Mol Diagn, 2010, 10(7): 937-946.

[24]張治國, 歐喜超, 孫倩, 等. 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術檢測痰標本中結核分枝桿菌及其耐藥性的研究. 中國防癆雜志, 2013, 35(1)：13-16.

[25]Del Portillo P, Murillo LA, Patarroyo ME. Amplification of a species-specific DNA fragment ofMycobacteriumtuberculosisand its possible use in diagnosis. J Clin Microbiol, 1991,29(10):2163-2168.

[26]Viana-Niero C, de Haas PE, van Soolingen D, et al. Analysis of genetic polymorphisms affecting the four phospholipase C (plc) genes inMycobacteriumtuberculosiscomplex clinical isolates. Microbiology, 2004,150(Pt 4):967-978.

[27]Andersen P, Munk ME, Pollock JM,et al. Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet, 2000, 356(9235):1099-1104.

[28]Balcells ME, Pérez CM, Chanqueo L, et al. A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int J Infect Dis, 2008,12(6):645-652.

[29]Higuchi K, Kawabe Y, Mitarai S, et al. Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med Microbiol Immunol, 2009, 198(1):33-37.