我國結核病病理學診斷和研究的現狀與展望

張海青 車南穎

病理學研究是醫學研究的起源，也是聯系臨床與科研的橋梁。結核病(tuberculosis)病理學研究早在19世紀初就有報道。著名病理解剖學家、胸科醫學的奠基者、聽診器的發明者René Théophile Hyacinthe La?nnec通過臨床觀察及病理解剖學研究，對結核病的發病原因、發展過程、診斷方法等方面進行了系統性闡述，并發表了影響整個醫學界的多篇論著[1-3]。之后在1882年，R. Koch發現了結核病的病原體結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)，并進一步支持了La?nnec等的觀點[4-6]。從1880年至1950年，結核病病理學研究非常活躍，通過觀察研究不同類型的結核病病理改變提出了很多結核病發病機制及診斷相關的觀點[7-10]。但在1950年前后抗結核藥物陸續出現之后，結核病的治療方式轉化為抗結核藥物療法[11]，外科手術及介入性治療逐漸減少，能獲取的人體組織標本隨之減少，結核病病理學研究也逐漸冷淡[12]。隨著微生物學的發展，結核病的診斷中細菌學檢測應用得更為廣泛。抗結核藥物出現后的幾十年里，很多人認為利用抗生素能消除結核病，因此結核病研究出現了降溫。但是20世紀末，結核病卷土重來，再次成為威脅全世界人類健康的首要傳染性疾病，耐多藥結核病甚至廣泛耐藥結核病的出現讓人們意識到結核病不能單單依靠抗結核藥物來控制或消除[13-15]。但現狀是沒有長期有效的抗結核疫苗，缺乏治療耐藥結核病的抗結核新藥，而這些問題需要我們進一步深入了解結核病發病機制和人體對抗結核病的免疫應答機制才能找到有效的解決途徑[16-17]。此外，結核病的早期快速診斷，特別是對菌陰肺結核及肺外結核病的診斷目前沒有很好的辦法[18-19]。這幾方面，我們都可以從人體組織病理學中尋找答案。了解病灶發生、發展和消除的原因及機制，我們就有可能找到解決問題的金鑰匙。因此，筆者將在結核病病理學診斷現狀、分子病理學診斷新技術應用展望及結核病分子病理學研究進展等3個方面進行闡述。

結核病病理學診斷現狀

病理學診斷是結核病確診的重要手段，傳統病理學診斷是通過大體和鏡下觀察病灶組織的病理形態學改變來獲得診斷結果，具有針對性強、準確性高等優勢。結核病具有特殊的病理學形態特點，如肉芽腫結構，包括類上皮細胞、朗罕(Langhans)細胞以及干酪樣壞死等，可與大多數其他感染性疾病及慢性炎癥進行鑒別診斷[20]。此外在標本中找到抗酸桿菌也是結核病病理學診斷的重要依據[20]。

目前結核病的病原體檢查主要依靠痰標本的細菌學檢查，但存在敏感度低，培養時間過長等缺點。由于菌陰肺結核與其他肺部疾病有時臨床癥狀及影像學變化有相似之處，會出現誤診，因此病理學診斷在此類疾病的確診中發揮著非常重要的作用[21-22]。另外，肺外結核病患者中臨床癥狀及表現差異很大，很多情況下不出現典型的癥狀，容易被漏診和誤診。王紓宜等[23]報道頭頸部黏膜結核病患者經常不具有典型臨床表現特征、無肺部或其他部位的結核病史，僅靠細菌學或影像學手段很難確診，可以通過病理形態學及抗酸染色檢查提高結核病診斷準確性。此外，在臨床診療中淋巴結結核與惡性淋巴瘤、乳腺結核與乳腺癌、盆腔結核與卵巢癌、食管結核與食管腫瘤，以及甲狀腺結核與甲狀腺腫瘤等疾病之間會出現很難鑒別診斷的情況，可疑的情況下有必要進行組織病理學診斷以獲得準確結論[24-28]。

雖然病理學診斷可以為結核病的確診提供有效準確的依據，但由于結核病主要類型為肺結核，且肺結核的治療主要依靠化療手段，手術及介入性治療只是在少數情況下才進行，所以獲得病灶組織標本的途徑有限。這是限制病理學診斷應用范圍的主要原因。但隨著近年來穿刺技術的迅速發展，如CT引導下的經皮肺穿刺活檢術、超聲引導下的針吸活檢術等具有微創、精準、便利、低風險等特點，為菌陰肺結核和肺外器官結核病的病理學診斷提供了更多的組織標本。常占平[29]利用CT引導下的經皮肺穿刺活檢術(computed tomography-guided transthoracic biopsy)對30例可疑肺結核進行診斷，其中29例可通過組織病理學獲得確診，而細菌學陽性率只有6.7%。顧曄等[30]利用氣管內超聲引導下針吸活檢術(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA)獲得了肺門縱膈腫物活檢標本，通過病理學診斷可以確診85.5%的結核病患者。Sun等[31]探索了EBUS-TBNA在肺結核診斷中的應用價值，發現病理學診斷可以確診80%的結核病患者，而細菌學培養只有46%的陽性檢出率。

近年來，隨著基因檢測技術的發展，分子生物學檢測技術也逐漸應用于病理學診斷中。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是通過特異擴增目標基因片段而獲得結果，具有敏感度高、可鑒別診斷結核病與非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)病等優勢。羅春英等[32]報道，在可疑的結核病組織標本中real-time PCR方法陽性檢出率為30.5%，顯著高于抗酸染色的陽性率14.4%(P<0.05)。王旭洲等[33]比較了real-time PCR與傳統抗酸染色及金胺O染色方法在組織標本中的結核病陽性檢出率，發現PCR方法的陽性率為51.5%，顯著高于抗酸染色和金胺O染色的陽性率(31.0%和40.5%)(P<0.05)，且可以鑒別出NTM。

總之，目前我國結核病病理診斷處于組織學和細胞學水平。病理診斷仍以結核病組織形態特征和查找病原體作為主要診斷依據。部分單位開展了一些結核病分子病理學的科研工作。由于PCR臨床檢測工作對實驗室、儀器設備及技術人員的要求比較高，目前國內只有少數大型醫院病理科開展了結核病的PCR檢測工作。

分子病理學檢測技術在結核病診斷中的應用展望

基于組織形態學及細菌學的傳統病理學診斷雖然是結核病確診的重要手段，但依然存在敏感度低及與其他疾病難于鑒別診斷等缺點。近年來，交叉學科融合的理念受到各界重視，分子生物學與病理學的交叉融合產生了一門新的分支學科分子病理學，將病理學的研究與診斷引領到蛋白質、核酸等生物大分子水平。

免疫組織化學法(immunohistochemistry，IHC)是在病理組織標本切片中檢測是否有目的蛋白的表達，在診斷腫瘤疾病及確定腫瘤分型中使用非常廣泛，但是在結核病病理學診斷中的應用較少。相比其他常見的免疫學檢測方法[如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、Western blotting等]，IHC對于抗體的要求更高。近年來，研究發現利用識別分枝桿菌抗原的抗體用于IHC檢查，可以提高結核病病理學診斷的敏感度。Ihama等[34]用抗結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MtbC)相對分子質量為38 000的抗原的單克隆抗體進行了腸結核的IHC檢測。結果顯示，相對分子質量為38 000的抗原主要分布在肉芽腫結構中的CD68+巨噬細胞內，染色呈顆粒狀分布。我院病理科也研制了針對分枝桿菌主要分泌蛋白Ag85B的多克隆抗體，并在結核病病理標本中探索了該分泌蛋白的表達特點及病理學診斷價值。對105例結核病及51例其他疾病石蠟包埋組織標本進行的抗酸染色及IHC檢測結果顯示，抗酸染色法的敏感度為31.4%，特異度為100%；IHC的敏感度為50.5%，特異度為100.0%。IHC與抗酸染色法相比顯著提高了陽性檢出率(χ2=7.877，P=0.005)，在肺結核中提高了14.8%(χ2=2.424，P=0.12)，在淋巴結核中提高了23.5%(χ2=5.923，P=0.015)(待發表)。

在核酸檢測方面，多種PCR新技術相繼問世，為結核病的分子病理學診斷提供了更多選擇。這些新技術可以進一步提高診斷敏感度，同時能快速鑒別診斷結核病與非結核分枝桿菌病，還能進行分枝桿菌菌型鑒定與耐藥基因突變檢測。Costa等[35]報道半巢式real-time PCR在結核病組織標本中的陽性檢出率為98.2%，與普通real-time PCR陽性率40%相比有大幅度的提高。Kukanich等[36]報道利用PCR及基因測序方法在狗和貓的組織標本中成功鑒定出鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)。Chen等[37]報道了一種巢式PCR聯合變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)分析來進行快速菌種鑒定的新方法。通過檢測16S rRNA、IS6110及IS1081基因序列，成功鑒定出MtbC及NTM。該方法可以檢測出全部細菌學培養陽性臨床標本及35.2%細菌學培養陰性標本中的分枝桿菌DNA，而且能在1 h內給出結果，具有快速靈敏的優點。Munkhdelger等[38]則報道利用膜反向雜交技術在石蠟包埋組織中成功鑒定多種NTM。該技術陽性率可以達到95%，與PCR及測序等方法相比具有分辨率高，快速便捷等優勢。他們還檢測了組織標本中Mtb菌株的利福平及異煙肼耐藥相關基因的突變情況，發現110例結核病中有1例出現利福平耐藥。

近年來，在痰標本、體液標本等臨床標本中的分子生物學檢測技術發展非常迅速，在臨床診斷中的應用非常廣泛；但在組織標本中的分子生物學檢測技術推廣比較慢，目前可用于臨床診斷的具有我國FDA認證的診斷試劑盒非常少。因此，還需要開展更多適合病理學診斷的新技術、新方法的研究，同時需要加快這些新技術的臨床驗證工作，促進其在結核病分子病理學中的臨床應用。今后，結核病病理診斷應在病理形態的基礎上，在尋找病原體、菌型鑒定及相關耐藥基因的檢測方面做更多努力，為結核病的正確診斷與合理化治療提供更準確的依據。

分子病理學在結核病基礎研究中的作用

病理解剖學是人類認識結核病的開始，結核病的診斷及治療理論起初都是由病理學家通過尸檢或對手術標本的病理學研究所建立的。通過直接觀察和分析病灶組織的病理學變化，我們可以對結核病的發病原因、發展模式、傳播途徑及治療效果等進行直接研究。到現在，結核病動物模型的體內實驗、最后評估依據都離不開病理解剖學的分析結果。但傳統病理學的大體及顯微鏡觀察等研究手段只能獲得組織及細胞層面的信息。隨著分子生物學與病理學的相互交叉滲透，20世紀70年代利用分子生物學技術研究疾病病因、發病機制、形態變化及功能損傷規律的新的分支學科分子病理學誕生。分子病理學研究主要集中在蛋白質、核酸等生物大分子水平，這為結核病病理學研究注入了新的生機。

1.在結核病發病機制研究中的作用：目前用于研究結核病的動物模型很多，人們通過研究這些動物模型中Mtb感染、擴散及消除，對結核病有了更加深入的了解。利用小鼠、獼猴等模型，Flynn研究團隊[39-41]深入研究了TNF-α在結核性肉芽腫形成與解體中的作用，發現TNF-α是肉芽腫形成所必須的細胞因子，如果TNF-α缺失肉芽腫形成會被延遲，且結構出現紊亂。這也是長期用抗TNF-α免疫治療的人群容易出現結核病復發的原因。此外，Davis等[42]利用斑馬魚模型研究了海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)感染斑馬魚后肉芽腫型病灶形成及播散變化，提出肉芽腫雖然是控制結核病的重要免疫病理反應，但在感染初期有可能起到促進結核病灶播散的作用。但也有研究人員提出，動物模型中研究結核病不能真實反映人體內發生的病理變化，因為不同種屬動物的結核病病理病變類型差異很大，如小鼠感染結核分枝桿菌后肺部很少會出現壞死性病變，但壞死性病變是人肺結核的基本病變類型。另外，在動物模型中重現繼發性肺結核比較困難，大部分動物模型研究都是采用初次感染，但人結核病大部分都是繼發性的[12,43]。

2.在結核病流行病學研究中的作用：結核病是一種古老的疾病，在古埃及木乃伊，中國古代墓葬中出土的干尸中都報道找到結核病病灶。由于微生物學是近代出現的學科，古代沒有菌種分離及保存技術，所以研究古代結核病流行病學，檢測組織標本是惟一可行的選擇。Lalremruata等[44]報道利用PCR方法獲得了古代埃及曾經流行結核病的證據。他們收集了古埃及金字塔中出土的16具木乃伊的軟組織標本，提取DNA后進行了PCR檢測，發現其中5具木乃伊組織標本中Mtb IS6110基因陽性。這一結果表明，當時該地區曾經流行過結核病。此外，福爾馬林固定的石蠟包埋組織在室溫中可以穩定存在幾十年，與苛刻的菌種保存相比更加安全和便捷，因此檢測組織標本中Mtb的基因信息可以為結核病流行病學研究帶來新的途徑。

病理學在人類認識結核病中起到了非常重要的作用，不僅開啟了結核病科學研究的大門，也為結核病臨床診斷和治療奠定了基礎。病理學研究對象主要是發病部位的組織及細胞，在疾病病因、發展及功能代謝機制研究中有著直接、真實等諸多優勢。隨著分子病理學的出現，結核病病理學研究又出現了新的生機。未來，分子病理學在結核病診斷及發病機制研究中將發揮更加重要的作用。

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