CAⅨ在腎癌中的研究進展

朱德勝 吳海嘯 吳漢

CAⅨ在腎癌中的研究進展

朱德勝 吳海嘯 吳漢

碳酸桿酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ），又稱G250、MN，是新發現的碳酸桿酶家族的異構體之一，基本功能為可逆性催化體內水合反應，被認為是腫瘤相關抗原,具有潛在判斷腎癌預后作用的分子標記物。筆者現對CAⅨ在腎癌診斷、治療及預后判斷中的應用作一綜述。

1 CAⅨ結構及功能

1.1 CAⅨ結構與分布 CAIX最早發現于人宮頸癌HeLa細胞系，Oosterwdk等[1]于1986年首次在腎癌中發現CAⅨ特異性的表達,其后發現該蛋白有與碳酸酐酶(CA)相似的結構，并被確認為是一種碳酸酐酶的異構酶，命名為CAIX（又稱G250、MN）。CAIX是一種位于細胞膜表面的糖蛋白，由酸性氨基酸組成的蛋白質，相對分子質量為58/54KD，由459個氨基酸構成，分別構成細胞內區、跨膜區和細胞外區3部分。細胞外區又分為蛋白多糖區（PG）和碳酸酐酶區（CA）兩部分。

人類CAⅨ基因位于9p12.13,共含有10 898個堿基。CAⅨ的抗體為M75和NB100-417，兩者在免疫組織化學方法中證實效價相當[2]。近來應用免疫組化的方法發現CAⅨ在多種腫瘤組織中有表達，而在正常組織中僅限于胃黏膜和膽管上皮細胞等有少量表達。姜耀東等[3]成功從腎透明細胞癌中提取DNA完成G250基因克隆測序分析，為蛋白純化提供了實驗依據。研究表明，90%以上的腎癌原發灶有CAⅨ表達，尤其是透明細胞癌全部有表達，88%的轉移灶有該抗原表達，因此CAⅨ具有良好的腫瘤特異性，是較理想的腫瘤標記物和腎癌治療靶點[4]。

1.2 CAⅨ的功能 CAⅨ是碳酸桿酶家族中的一員，為含金屬離子Zn+酶，基本功能為可逆性催化體內水合反應，使二氧化碳催化水合成碳酸氫鹽和氫離子（CO2+ H2O＜=＞HCO3-+H+），但其確切功能還有待進一步研究。在正常組織中表達的CAⅨ可能與以下3點功能有關：（1）調節細胞外的酸環境，維持電解質和酸堿平衡；（2）CAⅨ細胞表面有活性位點，為各種催化生理活動中提供H+或HCO-3；（3）需要HCO3-的生物合成反應活動中，比如電解質的分泌、骨的溶解與鈣化、脂肪形成、糖異生等。在腫瘤細胞中除上述功能可能還與以下功能有關：（1）使腫瘤細胞適應缺氧環境而存活；（2）阻止腫瘤細胞吸收弱堿性化學治療藥物，對化學藥物產生耐受；（3）存在致癌基因樣特征，在調控細胞增殖、轉化方面有重要的作用，可誘導惡性表型。

2 CAⅨ與腫瘤免疫

2.1 CAⅨ的表達 CAIX的表達是由缺氧誘導因子-1（HIF-1）轉錄合成的，在多數腫瘤細胞表面表達，但在大多數正常的組織中不表達。Lieskovska等[5]在體外研究發現內環境中的某些細胞因子可誘導CAⅨ的表達。Wykoff等[6]在體外缺氧誘導下，發現膀胱癌、子宮頸癌、肺癌等惡性腫瘤細胞中均發現有CAⅨ的表達。VHL基因在對CAⅨ的表達似乎有關鍵作用，在VHL突變的腎透明細胞癌細胞中發現表達率高，當引入野生型VHL基因到同樣的腎癌細胞株，可以發現CAⅨ在正常氧供環境中下調表達，在缺氧環境中誘導上調表達。CAⅨ基因啟動子中包含缺氧應答因子，且由HIF-1激活[6]。CAIX的表達已經被證實由轉錄因子即HIF-1α控制[7]。在正常氧供情況下，HIF-1α羥基化，通過與VHL蛋白（pVHL）結合的遍在蛋白化(作用)阻止形成活化的HIF-1α-HIF-1β復合物。在缺氧環境中，HIF-1α與pVHL結合受到抑制，HIF-1α與HIF-1β形成復合物，活化下游轉錄合成CAⅨ[8]。CAⅨ的表達與VHL蛋白密切相關，而在腎透明細胞癌患者常常存在VHL突變，因此在腎透明細胞癌患者中均發現有CAⅨ的表達[9]。Shin等[10]認為，其他惡性腫瘤，如子宮頸癌、肺癌、膀胱癌等，CAⅨ表達也是由缺氧誘導形成。在正常組織和腫瘤組織，CAⅨ的表達存在差別。免疫組織化學和RNA印跡技術表明在正常組織呈非常局限的表達，胃黏膜、胎兒的肺組織以及肌肉組織中有適量的表達，更多散在表達在小腸、膽道系統及男性生殖系統。相反，一項研究發現CAIX的mRNA在腎癌細胞中被大量發現[11]。Bui等[12]用CAⅨ的單克隆抗體行免疫組織化學方法檢測腎癌組織標本，發現90%以上的腎癌患者表達CAⅨ，且這種表達隨著病理分級的提高而降低。

2.2 CAⅨ與腎癌腫瘤免疫 腎癌細胞在快速生長的過程中會產生局部低氧區域，多個臨床研究表明腎腫瘤細胞對放射治療或化學治療不敏感與低氧有關。實驗表明，低氧可能促進腫瘤的遠處轉移[13]，低氧與遠處轉移的關系在子宮頸癌和軟組織肉瘤中已得到證實[4,14]。充足的組織細胞營養供給是保持細胞生理功能的基礎，腎癌細胞代謝旺盛，組織細胞氧供與消耗失去了平衡，通過血管再生可能是腫瘤獲得氧氣和能量的一個重要途徑。無氧代謝是另一個重要途徑，腎癌細胞在缺氧的環境中通過無氧代謝產生大量丙酮、乳酸等酸性代謝產物使內環境呈酸性。CAⅨ在腎癌細胞中的存在提示可以通過跨膜質子轉運調節細胞內的pH值使在酸性環境中存活[15]。

3 CAⅨ與腎癌治療

3.1 腎癌治療現狀 腎癌被認為是免疫性腫瘤，它對化療、放療均不敏感[16]，所以目前手術治療仍是主要的治療手段。對于有轉移的進展期腎癌，免疫治療是除外科手術外的重要治療方法，目前主要應用的是IL-2和INF-α。IL-2是美國FDA批準的用于晚期腎癌治療的細胞因子，也是目前國內外公認的治療進展期腎癌的一線用藥之一。但目前的臨床研究表明干擾素、IL-2在進展期腎癌中的治療作用有限。國外大量臨床隨機對照研究報道，單用IFN-α治療轉移性腎癌其有效率僅10%～20%。IFN-α和IL-2聯合并未顯示出明顯優越性[17]。2011年中國泌尿外科腎癌指南指出，雖然IFN-α聯合IL-2可提高對轉移性腎細胞癌治療的有效率，但單獨應用或者聯合應用均不能延長術后患者的總生存期和疾病無進展生存期。

目前靶向藥物在進展期腎癌中的療效得到肯定，推薦舒尼替尼、索拉非尼分別作為治療進展期腎癌的一線和二線治療用藥[18]。然而在臨床中發現部分腎癌患者對靶向治療藥物療效差甚至無效。在腎癌術后的藥物治療中，不管使用免疫治療、靶向治療，均無合適的方法挑選出藥物治療效果最佳患者，在臨床上迫切需要1種或幾種方法來判斷最適合相應治療方案的患者，而CAⅨ是很有潛力的判斷因子。

3.2 CAⅨ與腎癌的治療 腎癌CAⅨ的特異性表達在以下治療方法上提供了基礎：（1）細胞因子介導的免疫治療；（2）抗體介導的放射免疫治療；（3）CAⅨ為靶點的靶向治療。Ramsey[19]研究發現，不管在局限性還是在轉移性腎癌，CAⅨ的表達均提示對IL-2和IFN-α治療的反應性。2005年，Atkins等[20]通過對66例接受IL-2治療的患者觀察，發現CAⅨ表達陽性患者反應率達78%（21/ 27），而陰性患者只有51%（20/39），且CAⅨ表達陽性的患者中位生存期顯著延長達到5年以上。因此，CAⅨ的表達可能被用于轉移性腎癌的分層，并針對不同級別的轉移性腎癌采用相應治療方案。

目前腫瘤疫苗的策略是增強抗原的加工呈遞，在轉移性腎癌中，應用帶標記的單克隆抗體（G250 mAb）和CAⅨ致敏的樹突狀細胞的治療效果還處于臨床試驗Ⅰ期或Ⅱ期。齊桓等[21]證實CAⅨ致敏的樹突狀細胞瘤苗體外可有效的誘導特異性抗腎癌細胞效應。Lamers等[22]聯合IL-2利用鼠源性單克隆抗體制備的T細胞治療CAⅨ表達陽性腎癌患者獲得滿意效果。

自從靶向藥物應用于轉移性腎癌的治療后，其效果驚人，但Molina[23]發現，部分腎癌患者對靶向治療藥物無效，可能與腫瘤不依賴靶向藥物作用點如VEGE等有關。由此推斷，在靶向藥物作用點的上游因素如封閉HIF-1α，削減CAⅨ對腫瘤的細胞內環境的適應能力，結合免疫治療可能進一步提高靶向藥物的療效[23]。Choueiri等[24]對118例不同組織學類型患者研究發現，相對于舒尼替尼，CAⅨ陽性的患者對索拉非尼具有更好的反應性，且透明細胞亞型較其他組織學亞型具有更明顯的腫瘤縮小率。Osunkoya等[25-27]的研究發現，免疫組化及PCR方法均證實CAⅨ在透明細胞組織亞型中表達最高，與之前的研究結果一致。目前CAⅨ在靶向治療中的作用還缺少多中心大樣本研究，根據CAⅨ的表達情況選擇不同的靶向藥物可能是今后研究重點。

利用131I標記的CAⅨ單克隆抗體（M75/NB100-417）行放射免疫治療，使抗體靶向聚集殺傷表達CAⅨ陽性的腎癌細胞，為腎癌靶向治療提供另一個突破點。Brouwers等[28]已經證實，通過2個放射免疫治療周期可以有效阻止轉移性腎透明細胞癌的進展，但在其他病理類型中的療效還有待進一步明確。

4 CAⅨ在腎癌的診斷及預后判斷的作用

4.1 CAⅨ與腎癌的診斷 利用核素標記的針對CAⅨ的單克隆抗體（G250 mAb）進行腫瘤放射免疫顯像，有望用于腎癌的早期診斷及分期。使用124-I標記的CAⅨ抗體（G250 mAb）行PET檢查能夠準確判斷腎透明細胞癌，Divgi等[29]在一期臨床試驗中發現此檢查的敏感性、特異性分別達到94%、100%。

4.2 CAⅨ與腎癌的預后關系 多數學者研究認為，通過檢測腎癌術后CAⅨ的表達，可以更準確的判斷預后。高表達CAⅨ通常提示良好的預后，CAⅨ表達陽性率與腎癌的良好預后呈正相關，并且提示對系統治療具有更好的反應性。CAⅨ陽性表達可能改善了腎癌細胞中的缺氧環境，降低腫瘤遠處轉移的能力。Takacova[30]發現隨著病理分級的增加，CAIX的陽性率逐漸下降（50%T1 vs 17%T3）。Patard[31]通過對100例腎癌患者進一步研究證實，低表達CAIX和VHL基因的突變是獨立預后因素。Martino[32]對52例轉移性腎癌研究發現，高表達CAIX的腎癌患者具有更長的中位生存期（25.5個月vs8.5個月）和更好的IL-2治療反應性（37%vs 8%）。但Leibovich[33]通過對730例腎透明細胞癌患者研究并未得出上述結論。雖然單因素分析時，低表達CAⅨ與腎癌病死率相關，當結合腫瘤壞死、核級等多因素分析時，CAⅨ與腎癌死病率不存在相關性。導致與前幾項研究完全不同的結果可能有兩個原因：第一，在患者數量及構成比例上不同，本研究轉移性腎細胞癌只占11%，而其他研究達40%～60%；第二，免疫組織化學分析方法不同，本研究中使用微點陣方法而不是定量分析方法。多數研究認為，CAIX是一個獨立的腎癌標志物，低表達與腎癌的病死率呈正相關。

5 展望

在原發性腎透明細胞癌中，CAⅨ的表達是腎癌患者術后生存的預后因素，且能預測對IL-2治療的反應性。臨床上發現部分腎癌患者對靶向藥物無效，CAIX的表達水平是否和耐藥性相關還需要進一步研究。未來有望利用核素標記的G250 mAb進行腫瘤放射免疫顯像、放射免疫治療以及腫瘤疫苗的研究。根據CAIX篩選出免疫治療及靶向治療反應性好的腎癌患者，根據不同患者個體化選取經濟、高效、毒副反應小的系統治療方案可能是今后研究的重點。

[1]Oosterwdk E,Ruiter D J,Hoedemaeker P J,et al．Monoclonal antibody G 250 recognizes a determinant present in renal-cell carcinoma and absent from normal kidney[Z]．Wiley Subscription Services,Inc．,A Wiley Company,1986:38,489-494．

[2]Al-Ahmadie H A,Alden D,Qin L X,et al．Carbonic anhydrase IX expression in clear cell renal cell carcinoma:an immunohistochemical study comparing 2 antibodies[J]．Am J Surg Pathol, 2008,32(3):377-382．

[3]姜耀東,鄭少斌,王戰會,等．腎癌腫瘤相關抗原G250/MN/CAIX基因的克隆、表達及鑒定[J]．中華泌尿外科雜志,2006,27(2):3．

[4]Al-Ahmadie H A,Alden D,Qin L,et al．Carbonic Anhydrase IX Expression in Clear Cell Renal Cell Carcinoma:An Immunohistochemical Study Comparing 2 Antibodies[J]．The American Journal of Surgical Pathology,2008,32(3):377-382．

[5]Lieskovská J,Opavsk?R,Záciková L,et al．Study of in vitro conditions modulating expression of MN/CA IX protein in human cell lines derived from cervical carcinoma[J]．Neoplasma,1999,46 (1):17-24．

[6]Wykoff C C,Beasley N J,Watson P H,et al．Hypoxia-inducible expression of tumor-associated carbonic anhydrases[J]．Cancer research,2000,60(24):7075-7083．

[7]Kaluz S,Kaluzov M,Liao S,et al．Transcriptional control of the tumor-andhypoxia-markercarbonicanhydrase9:A one transcription factor(HIF-1)show[J]?Biochimica et Biophysica Acta(BBA) -Reviews on Cancer,2009,1795(2):162-172．

[8]Zhou G X,Ireland J,Rayman P,et al．Quantification of carbonic anhydrase IX expression in serum and tissue of renal cell carcinoma patients using enzyme-linked immunosorbent assay:prognostic and diagnostic potentials[J]．Urology,2010,75(2):257-261．

[9]Sandlund J,Oosterwijk E,Grankvist K,et al．Prognostic impact of carbonic anhydrase IX expression in human renal cell carcinoma [J]．BJU International,2007,100(3):556-560．

[10]Shin K H,Diaz-Gonzalez J A,Russell J,et al．Detecting changes in tumor hypoxia with carbonic anhydrase IX and pimonidazole [J]．Cancer Biol Ther,2007,6(1):70-75．

[11]Chiche J,Ilc K,Laferrière J,et al．Hypoxia-Inducible carbonic anhydrase IX and XII promote tumor cell growth by counteracting acidosis through the regulation of the intracellular pH[J]．Cancer Research,2009,69(1):358-368．

[12]Patard J J,Fergelot P,Karakiewicz P I,et al．Low CAIX expression and absence of VHL gene mutation are associated with tumor aggressiveness and poor survival of clear cell renal cell carcinoma[J]．Int J Cancer,2008,123(2):395-400．

[13]Pérez-Sayáns M,Supuran C T,Pastorekova S,et al．The role of carbonic anhydrase IX in hypoxia control in OSCC[J]．Journal of oral pathology&medicine:official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Acade-my of Oral Pathology,2012,42(1):1-8．

[14]Fyles A,Milosevic M,Pintilie M,et al．Long-term performance of interstial fluid pressure and hypoxia as prognostic factors in cervixcancer[J]．Radiotherapyand Oncology:Journal of the EuropeanSocietyfor Therapeutic RadiologyandOncology, 2006,80(2):132-137．

[15]Stillebroer A B,Mulders P F,Boerman O C,et al．Carbonic anhydrase IX in renal cell carcinoma:implications for prognosis,diagnosis,and therapy[J]．Eur Urol,2010,58(1):75-83．

[16]Staehler M,Tullmann C,Nuhn P,et al．Systemic therapy of renal cell carcinoma[J]．Urologe A,2010,49(12):1543-1550,1551．

[17]Cohen H T,McGovern F J．Renal-cell carcinoma[J]．N Engl J Med,2005,353(23):2477-2490．

[18]Pirrotta M T,Bernardeschi P,Fiorentini G．Targeted-therapy in advanced renal cell carcinoma[J]．Current medicinal chemistry, 2011,18(11):1651-1657．

[19]Ramsey S．The role of the systemic inflammatory response as a biomarker in immunotherapy for renal cell cancer[J]．Mol Diagn Ther,2009,13(5):277-281．

[20]Atkins M,Regan M,McDermott D,et al．Carbonic anhydrase IX expression predicts outcome of interleukin 2 therapy for renal cancer[J]．Clin Cancer Res,2005,11(10):3714-3721．

[21]齊桓,鄭少斌,譚萬龍,等．腎癌相關抗原G250致敏的樹突狀細胞瘤苗體外誘導特異性抗腎癌免疫[J]．南方醫科大學學報,2007,27(8):3．

[22]Lamers C H,Sleijfer S,Vulto A G,et al．Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX:first clinical experience[J]．J Clin Oncol,2006,24(13):e20-e22．

[23]Molina A M,Motzer R J．Clinical practice guidelines for the treatment of metastatic renal cell carcinoma:today and tomorrow[J]．The oncologist,2011,16（Suppl 2）:45-50．

[24]Choueiri T K,Regan M M,Rosenberg J E,et al．Carbonic anhydrase IX and pathological features as predictors of outcome in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma receiving vascular endothelial growth factor-targeted therapy[J]．BJU Int, 2010,106(6):772-778．

[25]Osunkoya A O,Yin-Goen Q,Phan J H,et al．Diagnostic biomarkers for renal cell carcinoma:selection using novel bioinformaticssystemsformicroarraydata analysis[J]．Humanpathology,2009,40(12):1671-1678．

[26]Oosterwijk-Wakka J C,Boerman O C,Mulders P F,et al．Application of monoclonal antibody G250 recognizing carbonic anhydrase IX in renal cell carcinoma[J]．Int J Mol Sci,2013,14(6): 11402-11423．

[27]Salinas-Sánchez A S,Giménez-Bachs J M,Serrano-Oviedo L,et al．Role of mitogen-activated protein kinase(MAPK)in the sporadic renal cell carcinoma[J]．Actas urologicas espa～nolas, 2012,36(2):99-103．

[28]Brouwers A H,Mulders P F A,de Mulder P H M,et al．Lack of efficacy of two consecutive treatments of radioimmunotherapy with 131I-cG250 in patients with metastasized clear cell renal cell carcinoma[J]．Journal of Clinical Oncology:official journal of theAmerican SocietyofClinicalOncology,2005,23(27): 6540-6548．

[29]Divgi C R,Pandit-Taskar N,Jungbluth A A,et al．Preoperative characterisation ofclear-cellrenalcarcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250(124I-cG250)and PET in patients with renal masses:a phase I trial[J]．The lancet oncology,2007,8(4):304-310．

[30]Takacova M,Bartosova M,Skvarkova L,et al．Carbonic anhydrase IX is a clinically significant tissue and serum biomarker associated with renal cell carcinoma[J]．Oncology letters,2013,5 (1):191-197．

[31]Patard J J,Fergelot P,Karakiewicz P I,et al．Low CAIX expression and absence of VHL gene mutation are associated with tumor aggressiveness and poor survival of clear cell renal cell carcinoma[J]．Int J Cancer,2008,123(2):395-400．

[32]de Martino M,Klatte T,Seligson D B,et al．CA9 gene:single nucleotide polymorphism predicts metastatic renal cell carcinoma prognosis[J]．The Journal of urology,2009,182(2):728-734．

[33]Leibovich B C,Sheinin Y,Lohse C M,et al．Carbonic anhydrase IX is not an independent predictor of outcome for patients with clear cell renal cell carcinoma[J]．J Clin Oncol,2007,25(30): 4757-4764．

2013-03-10）

（本文編輯：歐陽卿）

321000 金華市中心醫院泌尿外科

吳海嘯，E-mail：whxmjwz@yahoo.com.cn