高效液相色譜法測定大鼠血漿中的丹參酮IIA濃度及其藥代動力學(xué)研究※

●王曉萍 胡慶華

高效液相色譜法測定大鼠血漿中的丹參酮IIA濃度及其藥代動力學(xué)研究※

●王曉萍1胡慶華2▲

目的：建立高效液相色譜法測定大鼠血漿中丹參酮IIA含量的方法，并用于藥代動力學(xué)研究。方法：采用色譜柱為Phenomenex Luna C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相為1.6‰甲酸：甲醇（80：20 v／v），梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，紫外檢測波長343 nm。大鼠單劑量靜注10mg ·kg-1的丹參酮IIA，HPLC-UV法測定丹參酮IIA的血藥濃度，并采用DAS 2.0軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果：方法學(xué)實驗結(jié)果表明內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾丹參酮IIA和內(nèi)標(biāo)的測定，線性范圍0.039～10μg ·mL-1，定量下限為0.039μg·m L-1。方法精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和回收率均符合生物樣品測定的要求，適合大鼠血漿中丹參酮IIA濃度的測定，可以應(yīng)用該方法進行丹參酮IIA的藥代動力學(xué)研究。大鼠單劑量靜注10 mg·kg-1的丹參酮IIA后的AUC0→t、AUC0→∞、t1／2α分別為134.58±24.69μg·mL· min-1；135.36±24.76μg·mL·min-1；9.93±2.13min。結(jié)論：本方法操作簡便、靈敏、專屬性強，方法學(xué)考證符合生物樣品測定的要求并成功用于丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。

丹參酮IIA 高效液相色譜 藥代動力學(xué) 大鼠血漿

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，其化學(xué)成分分為脂溶性和水溶性兩部分。其中丹參酮IIA是脂溶性成分的代表，藥理學(xué)研究報道丹參酮IIA具有廣泛的生理活性，包括抗炎抑菌作用，清除自由基與抗氧化作用，保肝及改善肝功能，保護脊髓背角神經(jīng)元作用，保護腎小管的正常結(jié)構(gòu)和延緩腎間質(zhì)纖維化、抗癌、改善血循環(huán)等［1-3］。其中對心腦血管作用的研究在醫(yī)藥領(lǐng)域尤其在中藥領(lǐng)域受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視［4］。丹參酮IIA因其作用廣泛、毒性較低而具有較好的藥用前景。本文建立高效液相色譜法測定大鼠血漿中丹參酮IIA濃度，并用于丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。

1 試驗材料

1.1 儀器 島津（Shimadzu）高效液相色譜儀，包括LC-20AD送液泵、DGU-20A3在線脫氣機、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、CBM-20A系統(tǒng)控制器和Shimadzu Labsolutions色譜工作站；Milli-Q Gradient A10超純水器（Millipore Inc.USA）；Thermo SPD-2010-230臺式真空濃縮儀（Thermo Inc.USA）；Thermo Sorvall Stratos臺式高速冷凍離心機（Thermo Inc.USA）；Vortex-2旋渦混合器（Scientific Industries Inc. USA）等。

1.2 試劑 丹參酮IIA（批號Y0001560，含量≥99%）和內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗（批號C4397，含量≥99%）均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，色譜級甲醇購自德國Merck公司；其余試劑均為市售分析純。

1.3 實驗動物 SD大鼠10只，體重180～250 g，雌雄各半，購自購于南京江寧青龍山實驗動物中心，使用許可證號：SCXK（蘇）2007-0008。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精密稱取丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，用甲醇10.0 mL溶解定容，配制成500μg·mL-1貯備液，臨用時用超純水稀釋到相應(yīng)的濃度。內(nèi)標(biāo)液氯唑沙宗的配制：精密稱取氯唑沙宗10.00 mg，用甲醇溶解后，稀釋至40μg·mL-1備用。

2.2 血漿中測定丹參酮IIA的HPLC-UV色譜條件色譜柱為Phenomenex Luna 5μm C18（150 mm×4.6 mm），流動相：水相（A）1.6‰甲酸，有機相（B）甲醇（80∶20 v／v）；流速1.0 mL·min-1；柱溫40°C；紫外檢測波長為343 nm；進樣量20μL。

2.3 血漿樣品處理 取血漿樣品100μL，加內(nèi)標(biāo)10μL混均后，加300μL甲醇，振蕩3 min，15000 rpm離心10 min，取上清200μL，15000 rpm離心10 min，取上清150μL進樣。用樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比進行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 血漿中丹參酮IIA的測定方法學(xué)考察

3.1.1 方法特異性的考證 在本實驗條件下，大鼠血漿樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰有較好的分離度，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)與其他藥物代謝物不干擾測定，基線噪音小，表明該方法專屬性較好。丹參酮IIA的保留時間約為7.2min，內(nèi)標(biāo)保留時間約為8.2 min（圖1），說明該方法專屬性較高。在此條件下所測得的結(jié)果能代表丹參酮ⅡA濃度。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白大鼠血漿90μL，加10μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度分別為0、0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5和10μg· mL-1，按“血漿樣品處理”項下操作，記錄樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積，利用樣品濃度C對樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比R（As／Ai）作直線回歸，得回歸方程R＝1.2284C-0.0019，r2＝0.9995（n＝3），線性范圍0.039～10μg ·mL-1，最低定量下限0.039μg·mL-1。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗 分別考察了低（0.156μg· mL-1）、中（0.625μg·mL-1）、高（2.5μg·m L-1）3個濃度的含丹參酮IIA血漿樣品室溫放置6 h，反復(fù)凍融3次，-20°C冷凍放置2周，以及處理過的待測樣本在進樣器放置24 h的穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣品在儲存及測定過程中均穩(wěn)定，RSD均＜10%。

3.1.4 精密度和準(zhǔn)確度 用空白大鼠血漿配制低（0.156μg·m L-1）、中（0.625μg·m L-1）、高（2.5μg ·mL-1）3個濃度的樣品各5份，連續(xù)測定3d，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的藥物濃度，分別考察日內(nèi)和日間精密度與準(zhǔn)確度。實驗結(jié)果表明，低、中、高3個濃度的批內(nèi)和批間RSD均小于10%，準(zhǔn)確度為100.4%～107.2%。日內(nèi)精密度最大為6.09%；日間精密度最大為4.15%，均小于10%。

3.1.5 提取回收率 取1.5mL Eppendorf管數(shù)支，加90μL甲醇，精密加入不同量的丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成濃度分別為0.156、0.625、2.5μg·mL-1的丹參酮ⅡA溶液，平行制備5份，按“血漿樣品處理”項下操作，加300μL甲醇振蕩離心后，進樣分析，記錄色譜圖，記錄峰面積，進而計算求得峰面積均值另取1.5m L Eppendorf管數(shù)支，加90μL空白血漿，精密加入不同量的丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)液，配成含丹參酮ⅡA 0.156、0.625、2.5μg·mL-1的血漿樣品，平行制備5份。按“血漿樣品處理”項下操作，加300μL甲醇振蕩離心后，進樣分析，記錄色譜圖，求得丹參酮IIA在低（0.156μg·mL-1）、中（0.625μg·mL-1）、高（2.5μg·mL-1）3個濃度的提取回收率分別為（91.2 ±3.59）%、（92.9±4.13）%和（91.8±4.89）%，回收率符合要求且穩(wěn)定。

3.2 丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究 SD大鼠10只，雌雄各半，體重180～250g。禁食但可自由飲水12小時后，尾靜脈iv 10mg·kg-1丹參酮ⅡA（每100g體重iv 1mL）。于給藥前和給藥后2、5、10、15、30、40、50、60、75min，眼眶靜脈取血0.25mL于肝素化試管中，離心，分離血漿，置-20℃冰箱凍存至樣品分析。測得丹參酮IIA的平均血藥濃度-時間數(shù)據(jù)見圖2。利用DAS2.0軟件按統(tǒng)計矩法計算主要的藥代動力學(xué)參數(shù)：AUC0→t、AUC0→∞、t1／2α分別為134.58±24.69μg·mL-1；135.36±24.76μg·mL-1；9.93±2.13min（見表1）。

4 討論

本研究運用高效液相色譜法建立了大鼠血漿中丹參酮IIA血藥濃度的檢測方法，該方法簡便、穩(wěn)定、特異性強，為丹參酮IIA的動力學(xué)研究提供了方便、可靠的檢測手段。在建立本定量分析法的過程中，對流動相的配比、比例以及色譜參數(shù)等分析條件進行了優(yōu)化。對色譜柱進行選擇時，我們比較了Phenomenex Luna C18色譜柱、Waters XBridge C18色譜柱和Shimadzu Inertsil ODS-SP色譜柱，結(jié)果表明在Phenomenex Luna C18色譜柱上可以獲得分離完全、峰形對稱的色譜峰。

有文獻報道了丹參酮IIA在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)，實驗結(jié)果表明小鼠靜脈注射10mg·kg-1丹參酮IIA后其血藥濃度-時間曲線符合二房室模型，在小鼠體內(nèi)的分布迅速，消除速率較快，維持有效血藥濃度的時間較短，在1.5 h至4.0 h內(nèi)長期保持低濃度［5，6］。Li等建立了一個同時測定新西蘭大白兔血漿中丹參素、阿魏酸、丹參酮IIA和隱丹參酮的HPLC方法，并用于丹芎方的藥動學(xué)研究。研究表明，在耳緣靜脈注射丹芎方后（以丹參酮IIA計，給藥劑量為2.5mg·kg-1），丹參酮IIA的血藥濃度-時間曲線符合二房室模型，其t1／2α和t1／2β分別為2.47min和135.1 min［7］。此外，有文獻研究了丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃15mg·kg-1丹參酮IIA后，吸收相半衰期為0. 15 h，消除相半衰期為3.16 h屬于較短半衰期藥物［8］。同時有研究顯示丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)呈非線性藥物代謝動力學(xué)，暗示其吸收和代謝在大鼠體內(nèi)可能具有飽和性［9，10］。雖然已有文獻報道了利用LC-MS／MS的方法測定大鼠血漿中丹參酮IIA的血藥濃度并利用該方法進行了大鼠口服丹參酮IIA的藥代動力學(xué)研究，但作者并未報道大鼠口服丹參酮IIA的藥代動力學(xué)參數(shù)，但可知大鼠口服5mg·kg-1丹參酮IIA后，其血藥濃度維持在較低水平，峰濃度不到50 ng［11］，提示丹參酮IIA的絕對生物利用度較低，口服吸收較差。到目前為止尚未有詳細(xì)闡述靜脈注射丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究的報道。

本研究建立的丹參酮IIA檢測方法及其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)實驗結(jié)果，將為今后全面評價丹參酮IIA的體內(nèi)外藥代動力學(xué)提供一定參考依據(jù)。

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醫(yī) 論

陰陽對待流行說

人身之陰陽，有對待，有流行。對待者，一而二也，流行者，二而一也。非對待無以立陰陽之用，非流行無以見陰陽之用。故人之心腎二也，氣血二也，水火二也。上下各有其位，左右各循其途，兩者相為對待依附而不可離也。然水中有火，火中有水，氣以行血，血以行氣。心根于腎，腎根于心，二者又無始無端互為其宅而不可分也。夫心腎，陰陽之根抵也。言心腎，而水火氣血皆在其中矣。今但以心腎言之，心為離火而實火之主，腎為坎水而實水之源，故坎中之陽必升，升則陰隨陽發(fā)，十土由茲而癖，八木由茲而茂，而兩丁之火乃光焰燭天矣。離中之陰必降，則陽隨陰斂，五土由是而闔，九金由是而凝，而壬癸之水乃滔滔不竭矣。即如四時之運行亦然。春夏陽之升也，而濃云驟雨，草木敷榮，非陰隨陽發(fā)之征乎！秋冬陰降斂也，而萬寶堅凝，冰霜凜冽，非陽隨陰斂之象乎？然此陰陽升降，流行不息，偏不倚無過不及者，有中道焉。過則必至于亢害，不及復(fù)至于凝滯。在天地為時令之失正，在人身則寒熱之偏陂。古之圣人與日月合其明，四時合其序者，體其道也。

（摘自清·芬余氏《醫(yī)源》）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.SFC 81202573）▲通訊作者 胡慶華，男，副教授，主要從事藥學(xué)研究。E-mail：huqh＠cpu.edu.cn

1.江蘇省鹽城市婦幼保健院藥事科（224002）；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院（210009）