Klotho基因與腫瘤關系的研究進展

余勝 胡智明 陶厚權

●綜 述

Klotho基因與腫瘤關系的研究進展

余勝 胡智明 陶厚權

Klotho基因是Kuro-o等[1]在研究自發性高血壓時發現的與人類衰老密切相關的基因。該基因與人類心血管疾病、腎臟疾病及骨質疏松等衰老性疾病密切相關。近年來的研究認為Klotho基因的異常表達可能參與到腫瘤的發生、發展，作為一個抑癌基因參與調控多種腫瘤的生物學過程[2]。本文現就Klotho基因及其與腫瘤的關系進行綜述。

1 Klotho基因及蛋白的生物學特性

1.1 Klotho基因結構 人類的Klotho基因定位于染色體13q12，全長約50kb，包括5個外顯子和4個內含子。在Klotho基因的結構中，有一個潛在的可變剪切位點存在于其mRNA上，定位于外顯子3中，如果此位點接受了一個50bp片段的插入，該序列末斷的兩個核苷酸TA就會與外顯子4的第一個核苷酸G一起而構成一個終止密碼TAG，使得RNA由此截斷形成一個短的開放閱讀框，僅含3個外顯子和2個內含子而編碼分泌型蛋白（Klotho-S）；但如果可變剪切位點沒有接受此50bp片段的插入，其RNA就是一個完整的結構，外顯子全部表達，編碼形成膜型蛋白。因此，Klotho cDNA包括全長約3 036bp的膜型Klotho cDNA及全長約1 647bp的分泌型Klotho cDNA[3]。

1.2 Klotho蛋白結構與功能 由于Klotho mRNA剪切位點的存在，Klotho基因表達兩種低聚體的蛋白：含有1 012個氨基酸的膜型蛋白和含有549個氨基酸的分泌型蛋白[3]。膜型Klotho蛋白為一種單跨膜蛋白，包括一個N末端信號序列、含有兩個內部重復序列KL1和KL2的胞外區、一個單跨膜區和一個短的胞內區（此區為無功能區），胞外區KL1和KL2之間有一段賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-賴氨酸序列，可能作為蛋白酶裂解位點，有被裂解而釋放胞外段的可能；分泌型Klotho蛋白僅含有N末端序列和KL1胞外區。Klotho的這兩種蛋白形式，有著不同的生物學特性，膜型Klotho蛋白主要作為成纖維細胞生長因子23（FGF-23）的輔助受體，為FGF23提供一個高親和性的結合位點[4]，參與磷酸鹽代謝的調節；分泌型Klotho蛋白可以調節多個離子通道的活性，具有潛在的糖苷酶活性，更重要的是，它能夠抑制體內一些重要的細胞信號轉導，在人類衰老、衰老相關疾病及腫瘤發生、發展中扮演重要的角色。

Klotho基因高表達于腎臟遠曲小管以及腦脈絡膜，也可在胎盤、前列腺、睪丸及卵巢等性激素依賴器官及小腸中檢測到其低表達。人類以編碼分泌型Klotho蛋白為主，目前認為，Klotho基因的表達局限于某些特定組織，但其突變后可以引起表型的改變而涉及多種組織器官，也就是說，Klotho蛋白可能作為一種內源性循環激素存在于人體[5-6]。研究發現，給予可溶性的Klotho蛋白或Klotho過表達細胞的條件培養液都能有效抑制乳腺癌及胰腺癌等腫瘤細胞的生長[7-9]，并且，Klotho對腫瘤的抑制活性可能是通過其內部的重復序列KL1來調控[9]。因此，分泌型蛋白可能為Klotho蛋白在人體內的主要活性形式。

1.3 Klotho基因多態性 存在于Klotho基因上的單核苷酸多態性（SNPs）大約有400多個，能夠影響轉錄和蛋白表達的主要是位于啟動子區的16個SNPs及位于外顯子區的15個SNPs，這些SNPs與人類多種疾病發生有關，包括心血管疾病、骨質疏松及腎臟疾病等[10-12]。目前對其與腫瘤的關系研究較少，研究最多的是KLVS，這是Arking等[13]發現的一種等位基因，包含有6個SNPs，為完全連鎖不平衡，編碼區域（外顯子2區內）有3個SNPs，其中一個為無義突變，另外兩個為F352V（rs9536314）和C370S（rs9527025），可導致氨基酸置換引起錯義突變，分別為苯丙氨酸替換為纈氨酸、半胱氨酸替換為絲氨酸，影響Klotho蛋白的分泌及酶活性等。Wolf等[14]研究了1 115名德系猶太婦女，發現在突變體等位基因BRCA1的攜帶者中，等位基因KLOTHO-V的雜合型可以增加乳腺癌及卵巢癌的發病風險，并且該突變與BRCA2之間存在著連鎖不平衡，認為KL-VS可能是通過改變BRCA1和BRCA2基因的外顯率來增加攜帶者罹癌腫瘤的風險。但是，Laitman等[15]的一項研究卻沒有發現這種關系，該研究包括5 741例BRCA1及3 339例BRCA2攜帶者，發現KL-VS并不會改變BRCA1和BRCA2攜帶者中發生乳腺癌及卵巢癌的風險，不過該研究中德系猶太婦女樣本量小，且KL-VS具有顯著的種族特異性，因此，尚不能確定KL-VS與猶太德系婦女中BRCA1和BRCA2攜帶者腫瘤風險增加的相關性。Wolf等[14]的研究還發現，KLOTHO-V對乳腺癌細胞也存在生長抑制作用，但較野生型的Klotho對細胞的生長抑制活性下降，分泌量也顯著減少，Abramovitz等[9]在胰腺癌細胞株中同樣檢測到該功能突變體，提示這種活性減弱的KL-VS變體與胰腺癌風險增加有關。其他如啟動子-395也存在G-A變異，該等位基因由Kawano發現，認為G-A替換可抑制Klotho基因的轉錄，降低Klotho蛋白的表達[16]，我國學者孟慶玲[17]發現Klotho基因啟動子區G-395A多態與江蘇地區人群的胃癌發病危險性呈顯著相關，攜帶A等位基因患者發生胃癌的危險性明顯高于攜帶G等位基因的患者。

2 Klotho與腫瘤

2.1 Klotho基因是抑癌基因 Wolf等[7]于2008年首次提出了Klotho基因是潛在的乳腺癌的抑癌基因，免疫組織化學技術發現，正常乳腺上皮細胞表達Klotho蛋白，而原位導管癌和侵襲性乳腺癌中表達卻顯著減少。隨后，研究者在胃癌[18]、結直腸癌[19]、胰腺癌[9]、肝癌[20]、肺癌[8，21]及宮頸癌[22]等多種腫瘤中也發現這種差異性表達；研究還發現，在正常乳腺上皮及輕度增生的乳腺上皮細胞中Klotho高表達，在中、重度增生的乳腺上皮及不典型性導管增生組織中低表達[23]，該蛋白在正常乳腺上皮、增生的乳腺上皮、原位導管癌及侵襲性乳腺癌中的表達水平呈逐漸下降的趨勢[7，23]，Lee等[22]也注意到Klotho mRNA在浸潤性宮頸癌樣本中表達缺失，而在宮頸癌早期或浸潤前期可以檢測到其表達。這提示Klotho的表達下降可能是腫瘤發生中的一個早期事件，并可能與腫瘤轉移有關。此外，通過細胞實驗，敲除腫瘤細胞中內源性Klotho基因，可促進腫瘤細胞的增殖，而過表達Klotho基因的腫瘤細胞增殖及侵襲能力明顯降低[7，21-22，24-25]；動物實驗也發現，實驗組小鼠（經尾靜脈注射肺癌細胞A549KL）較對照組小鼠（經尾靜脈注射肺癌細胞A549mock)的生存期顯著延長，且實驗組小鼠肺內形成的轉移灶也明顯較少[26]；對接種胰腺癌細胞PANC-1的小鼠給予Klotho/Klotho-S治療，可顯著抑制小鼠體內的腫瘤生長[9]，這都表明Klotho基因對腫瘤細胞具有生長抑制作用并可降低其惡性表型。總之，現有的研究資料強力提示Klotho基因在腫瘤的生物學進程中扮演著抑癌基因的角色。

抑癌基因失活的表觀遺傳學改變主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑等，為探尋Klotho基因沉默的表觀遺傳機制，研究者運用重亞硫酸鹽測序PCR、甲基化特異性PCR等技術，檢測到腫瘤組織及腫瘤細胞株中Klotho基因啟動子區高甲基化狀態及啟動子相關組蛋白去乙酰化狀態，在對這些腫瘤細胞系以單獨或聯合DNA甲基轉移酶抑制劑（5-氮雜-2′-脫氧胞苷）及組蛋白去乙酰化酶抑制劑（曲古霉素A）后，可使Klotho的表達部分或完全恢復[9，20，22，24-25]。因此，Klotho基因在腫瘤中表達下調或缺失與DNA甲基化和組蛋白去乙酰化有關。

2.2 Klotho與腫瘤的臨床病理關系 通過對Klotho表達與腫瘤患者臨床病理特征之間的關系分析，發現Klotho蛋白表達陽性與胃癌患者的臨床分期、淋巴結轉移呈負相關性[18]，Klotho mRNA在結直腸癌組織中的表達明顯下降，并與患者年齡分布有顯著相關性，特別是50歲以后年齡段，隨著年齡的遞增，Klotho mRNA表達呈現遞減[19]。Usuda等[27-28]認為，對手術切除的小細胞肺癌及大細胞神經內分泌肺癌患者，Klotho陽性表達預示較好的臨床預后。此外，有研究發現，該基因啟動子區的高甲基化狀態與胃癌及肝癌患者的預后也密切相關[20，24]。因此，檢測腫瘤組織中Klotho基因的表達及其啟動子區的甲基化狀態或許可以作為腫瘤診斷及預后判斷的一種可靠手段。

2.3 Klotho調控的腫瘤相關信號通路 Klotho參與腫瘤的發生、發展，可能是依賴于調控細胞的多種信號轉導通路而實現，通過對細胞膜上的特殊受體活性的調節，導致細胞信號傳遞異常，而出現這些通路的傳遞受阻或異常活躍，正常的調控紊亂，從而導致腫瘤發生或者促進其發展。

Insulin/IGF-1通路是與生命進化密切相關的信號通路，該信號可以活化Ras-MARK和PI3K/Akt通路，從而促進腫瘤細胞生長。Wolf等[7]發現，敲除乳腺癌MCF-7細胞中的Klotho基因可促進IGF-1所致的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的磷酸化，而過表達Klotho基因則減弱IGF-1誘導的IGF-1受體、胰島素受體底物1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1和胞外信號調節激酶1、2的磷酸化；過表達Klotho基因同樣可以減弱胰腺癌細胞Panc1、MiaPaCa2、Colo357中這些受體的磷酸化[9]。Chen等[21]研究發現Klotho過表達可以顯著抑制肺癌細胞增殖，但能被IGF-1所逆轉，實驗還發現，過表達Klotho基因的肺癌細胞中IGF-1及Insulin受體的磷酸化明顯受到抑制，而給予Klotho基因沉默的肺癌細胞以IGF-1或insulin刺激后，IGF-1/Insulin受體的磷酸化顯著增加。可見，Klotho對腫瘤的生長抑制作用部分可能通過抑制Insulin/IGF-1信號通路來完成。

Wnt信號通路是一條在進化上保守的信號途徑，該通路的異常激活與多種腫瘤發生緊密相關。Liu等[29]在研究Klotho的抗衰老特性時發現，Klotho蛋白是一種分泌型的Wnt拮抗劑，可能通過減弱Wnt蛋白與其受體的結合而抑制Wnt信號轉導。近年的研究認為，Klotho在腫瘤中的表達缺失可激活異常的Wnt通路。在宮頸癌及肺癌細胞系中過表達Klotho/Klotho-S可使這些細胞中活化的β-catenin水平顯著減少，并抑制T細胞因子/β-catenin下游靶基因（如原癌基因c-Myc、CyclinD1）的轉錄，而在Klotho沉默的肺癌細胞系中無此抑制作用[8，22，30]，這些跡象表明Klotho/Klotho-S可以抑制腫瘤細胞中Wnt信號傳遞。Camilli等[31]指出，Klotho可阻止HSPG介導的Wnt5A攝取及信號傳遞，其表達缺失增加了黑色素瘤細胞中Wnt5A的表達以及Wnt5A所介導的細胞侵襲遷移潛能；此外，Klotho-S異位表達可以減少肺癌細胞系中Wnt3a mRNA的表達水平，且Klotho-S還可抑制Wnt3a的內化，使功能性Wnt3a減少，從而抑制Wnt3a信號傳遞及其介導的細胞生長[8]。因此，Klotho在腫瘤細胞的表達缺失或下降可激活Wnt3a、Wnt5a相關的經典的Wnt/β-catenin信號通路或非經典的Wnt通路，進而影響細胞的生長、遷移等。

上皮向間質細胞的轉變（EMT）是組織損傷后機體自我修復的生理機制之一，也可參與多種臟器的病理過程，如肝、腎、心的纖維化，也可促進腫瘤侵襲轉移。Chang等[30]發現Klotho的異位表達可通過上調宮頸癌細胞中的細胞黏附相關基因（E-cadherin）、下調神經鈣黏素（N-cadherin）以及減少基質金屬蛋白酶（MMP）7、9及EMT轉錄因子（Slug、Twist）的表達，而抑制EMT發生，減弱腫瘤細胞的活力及侵襲力。TGF-β1是誘導EMT發生的最重要的生長因子，其主要通過誘導Smad信號蛋白參與EMT過程，TGF-β1與II型TGF-β受體的結合（TGFβR2）可以激活I型受體（TGFβR1），活化的TGFβR1使Smad2/3磷酸化增加，磷酸化的Smad2/3轉移至細胞核后作為轉錄因子存在，調節下游靶基因TGF-β1的表達。Doi等[26]認為Klotho抑制肺癌細胞系A549中TGF-β1誘導的EMT發生，Klotho與TGFβR2結合，以競爭性抑制或者改變受體構象的方式阻礙TGF-β1與TGFβR2結合，抑制TGF-β1誘導的Smad3磷酸化，影響TGF-β1信號傳遞，阻礙EMT過程，減少腫瘤轉移。

此外，Klotho可以提高乳腺癌細胞對bFGF的敏感性而促進FGF通路的活化，上調CCAAT/增強子結合蛋白β的表達來抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長，通過提高MCF-7中p53的表達及胃癌細胞AGS、MKN28中p21的表達而調控腫瘤細胞生長周期，抑制細胞增殖，上調bax和下調bcl-2基因以促進肺癌細胞A549的凋亡[7，21，24]。

3 小結與展望

目前認為Klotho基因是一種抑癌基因，該基因的功能性缺失可通過影響信號轉導的各個環節，使細胞生長、增殖及凋亡作用失衡，而使細胞癌變。Klotho基因的抗衰老特性所表現出的腎臟、心血管保護作用，或許可能為腫瘤的靶向治療提供新的思路；而其與腫瘤轉移之間的關系，或許可以成為評估腫瘤轉移潛能、預后判斷的新指標，甚至成為腫瘤晚期治療的突破口。但是，對Klotho基因調控腫瘤發生、發展的生物學過程仍缺乏足夠認識，需要進一步深入研究。

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2013-11-21）

（本文編輯：田云鵬）

310014 杭州，浙江省人民醫院胃腸外科、浙江省胃腸病學重點實驗室（余勝、陶厚權）；海寧市第三人民醫院（胡智明）

陶厚權，E-mail:taohouquan2008@aliyun.com