蛋白質組學在肥胖和胰島素抵抗及2型糖尿病中的應用研究進展

王銘婕，閆朝麗

肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病作為糖尿病發生的三步曲，關系十分緊密。目前得到大家認可的蛋白質組學已經運用在動物細胞、組織成為一種新興的技術手段，而應用于肥胖、胰島素抵抗和糖尿病患者的血清、組織細胞甚至唾液和尿液的蛋白質相關分析更加直觀，臨床指導作用更強。進一步在蛋白水平上揭示肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病之間的關系，為解釋疾病發生發展機制、預防和診斷2型糖尿病以及糖尿病相關藥物的開發提供思路。本文就蛋白質組學在肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病中的應用及進展作一綜述。

1 蛋白質組學概述

蛋白質組(proteome)的概念首先由澳大利亞學者Wilkins等于1994年首次提出，源于蛋白質(protein)和基因組的(genome)的整合，指一個細胞內存在的全部蛋白質[1]。蛋白質組本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此整體而全面地認識蛋白質水平上關于疾病發生發展的過程。目前蛋白質組學研究較多使用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和質譜法(mass spectrometry，MS)。

2-DE是等電聚焦電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)的組合，即先進行等電聚焦電泳(按照pI分離)，然后再進行SDS-PAGE(按照分子大小)，經染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。MS即用電場和磁場將運動的離子按質荷比分離后進行檢測的方法，目前多用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，主要用于對生物大分子物質和有機小分子化合物分子量的測定以及對蛋白質進行高通量的鑒定。

2 蛋白質組學的應用

蛋白質組學作為大規模水平上蛋白質篩查的方法，可鑒定出大量蛋白質，但是目前對其中的一部分蛋白質認識甚少，還需要在確定其種類的基礎上對其功能學及與疾病的關系深入了解。從下文可知，同時發現的大量差異蛋白具有共同的生理或病理作用，因此可作為相關聯的一組蛋白群整體研究。由于肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病不是完全分隔開的幾個階段，本文根據研究對象所處的主要病理狀態進行分類表述。

2.1 蛋白質組學與肥胖 糖尿病的危險因素主要有糖耐量受損、家族史和肥胖，其中肥胖是2型糖尿病的最重要誘因之一[2]。鑒于肥胖人群中糖尿病的高發病率及當今肥胖的高流行，找到肥胖對糖尿病的誘發機制十分必要，其機制的明確將為肥胖型糖尿病的預防和控制提供新的思路。

Brockman等[3]經MS鑒定出的14-3-3在肥胖早期小鼠脂肪組織表達上調，肽基脯氨酰順反異構酶Pinl在肥胖小鼠脂肪組織表達下調，這可能與其細胞增殖、分化和保護作用相關。噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的激動劑，已經證明TZD可以恢復脂肪細胞相關功能障礙，如炎癥活動和胰島素抵抗。Chen等[4]用MALDI-TOF-MS分析有無TZD治療的肥胖大鼠的內臟脂肪組織，通過液相色譜及MS證明，利用TZD治療12 d后，77種蛋白質水平發生改變，包括炎性分子、細胞外基質蛋白質、膠原蛋白和免疫因子等，這些蛋白質可能具有改善脂肪細胞功能的作用，從而得出TZD治療可以提高胰島素敏感性的結論。Tvarijonaviciute等[5]利用2-DE對比格犬控制體質量前后的血清蛋白組學進行分析，繪制出肥胖組和消瘦組的蛋白圖譜，對比顯示有3個點存在差異，鑒定后得到視黃醇結合蛋白4、凝聚素的前體表達上調，抗胰蛋白酶1表達下調。凝聚素作為載脂蛋白對血脂的調節有重要影響，而視黃醇結合蛋白4作為新近發現的一種脂肪因子，其升高與胰島素抵抗、肥胖及多種心血管危險因子密切相關。王俊等[6]利用游離膠分餾器(OFFGEL)電泳-差異蛋白質組學的方法對肥胖亞型、非肥胖亞型糖尿病患者組和對照組分別鑒定出391、415、371 種差異蛋白，結果表明脂聯素在肥胖亞型糖尿病患者血漿中低表達，基質交感分子1 (stromal interaction molecule 1，STIM1) 在肥胖亞型糖尿病患者血漿中高表達。STIM1是鈣庫操控鈣通道(store-operated channels，SOC)的感受器，通過調控鈣庫，操控鈣內流，補充細胞內鈣離子濃度。在糖尿病及肥胖患者體內鈣離子水平表現出細胞內高鈣而體鈣缺乏，這可能與STIM1高表達有關；絲氨酸蛋白激酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等6種蛋白激酶在非肥胖亞型糖尿病患者血漿中高表達。脂聯素、STIM1和一系列蛋白激酶在肥胖亞型、非肥胖亞型糖尿病的發病機制上可能存在差異。

Bae等[7]利用2-DE-差異蛋白組學研究發現在肥胖者的胰島素敏感組織如肝臟、骨骼肌和脂肪組織中存在大量的差異蛋白，其中白細胞共同相關抗原磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶α( protein tyrosine phosphatase α，PTP-α)、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)均有高表達，后續研究證明這些酶參與胰島素信號轉導。Kim等[8]利用2-DE分析肥胖人群血漿，并用酶聯免疫吸附試驗進行驗證，結果表明在肥胖人群中血漿銅藍蛋白和纖維蛋白原水平明顯升高，且與肥胖程度呈正相關。Insenser等[9]選取了6例病態肥胖患者及6例正常人的皮下組織及內臟脂肪組織，利用2-DE和MALDI-TOF-MS對其進行分析，結果顯示羧酸酯酶-1、14-3-3等蛋白水平在肥胖患者中增高，補體C3、纖維蛋白原C鏈、清蛋白、α1-抗胰蛋白酶和過氧化物酶6等下降。Oliva等[10]對糖耐量正常的肥胖和正常孕婦剖宮產后的胎盤蛋白進行研究，結果顯示肥胖患者的人膜聯蛋白A5、ATP合酶β亞基、腦酸溶性蛋白1(brainacidsolubleprotein 1，BASP1)、鐵蛋白輕鏈、波型蛋白降低，α-1-抗胰蛋白酶、葡萄糖調節蛋白75(glucose-regulated proteins 75，GRP75)升高。這些蛋白質在調節生長、構建細胞骨架、氧化應激、炎癥、凝血和凋亡中發揮作用，其改變可能對胎兒的生長發育有重大影響。上述研究均利用非定向蛋白組學方法找出了正常人與肥胖患者間大量的新型差異蛋白，并推測這些蛋白可能與肥胖的發展有關。

2.2 蛋白質組學與胰島素抵抗 胰島素抵抗指一定量的胰島素與其特異性受體結合后所產生的生物效應低于正常。表現為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖攝取減少及胰島素抑制肝葡萄糖輸出的作用減弱[11]。胰島素抵抗的發生、發展是多因素、多基因及多階段的復雜過程，用蛋白質組學策略從整體水平來探討胰島素抵抗的發生與發展規律，為研究者提供了預防和治療糖尿病的思路。

Lim等[12]為了增加準確度，利用單向電泳和2-DE兩種方法找到差異蛋白，平行進行MS，比較胰島素抵抗大鼠與正常大鼠脂肪細胞中的蛋白質，差異蛋白包括補體C6、金屬蛋白酶組織抑制物1、組織蛋白酶B、脂蛋白、硫氧還原蛋白、凝溶膠蛋白等，均參與了免疫反應、細胞外組織重塑和氧化應激。Kameji等[13]研究發現，存在氧化應激和胰島素抵抗的小鼠脂肪細胞中，腫瘤壞死因子α水平升高；Yan等[14]發現茶中的兒茶素可以減少血清中的腫瘤壞死因子α水平，從而衰減活性氧的產生和緩解胰島素抵抗。

Giebelstein等[15]利用2-DE及高效液相色譜與MS聯用技術分析胰島素抵抗患者的骨骼肌，結果表明糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸葡萄糖變位酶2、骨骼肌烯醇化酶和丙酮酸激酶等的水平明顯高于正常人，與上述糖酵解酶水平增加相反，線粒體蛋白烯酰基輔酶A異構酶水平減少，表明糖酵解酶的增加和線粒體蛋白的減少可能導致胰島素抵抗和2型糖尿病。

2.3 蛋白質組學與2型糖尿病 糖尿病是由胰島素分泌異常和/或胰島素活性異常所導致的一種代謝疾病，此疾病會引起伴隨糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂的高血糖癥狀[16]。作為引起疾病的主要標志物或作為由疾病引起的繼發效應，蛋白質水平的變化對疾病的研究意義重大。

2.3.1 組織中的蛋白質組學研究 Mullen[17]應用2-DE技術研究了正常大鼠與糖尿病GK大鼠腓腸肌線粒體中的蛋白質，發現煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶、細胞色素b-c1復合物、異檸檬酸脫氫酶等蛋白在內的線粒體標志蛋白在糖尿病模型GK大鼠中表達量均顯著降低。Han等[18]利用放射性核素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ) 技術在肥胖大鼠、肥胖糖尿病大鼠以及正常大鼠的胰島組織中進行研究，在肥胖糖尿病大鼠與正常大鼠的比較中發現54個差異蛋白，在肥胖大鼠與正常大鼠之間發現58個差異蛋白，并且首次發現了一些與胰島素損傷、線粒體功能紊亂、細胞外基質蛋白、微血管缺血相關的蛋白質。Essop等[19]分離出18～20周雌性db/db鼠心臟組織中的線粒體研究發現ATP合酶D鏈、輔酶細胞色素C還原酶核心蛋白1和電子轉移黃素蛋白亞基α水平增高，α平滑肌肌動蛋白、α心肌肌動蛋白、肌球蛋白重鏈α和肌球蛋白結合蛋白C水平下降，以上蛋白水平的改變可能與心臟收縮功能下降有關，從而引起糖尿病大血管病變等相關并發癥。Zhang等[20]利用2-DE和MS對患有2型糖尿病腎病的db/db鼠腎臟進行研究，db/m鼠作為對照組。經對比及鑒定發現，天冬氨酸酰酶3、環氧化物酶2、D-乳酸脫氫酶、蛋白激酶C抑制劑蛋白1、E鈣黏蛋白豐度下降，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的第2合成酶(HMGCS2)、線粒體酰輔酶A合成酶2、醛縮酶B亞型2、波形蛋白、免疫球蛋白重鏈V類似物豐度上升，上述蛋白可能與增強上皮細胞-間充質轉分化有關，上皮細胞-間充質轉分化會導致腎小管上皮細胞重塑為成纖維細胞，失去原有功能。HMGCS2是生酮作用中的關鍵酶，其增加表明2型糖尿病患者腎臟具有高于常人的生酮作用。總的來說，這些研究結果表明糖尿病腎臟具有多余的生酮活動，糖尿病腎病中增強的酮體生成作用可能為一種新的糖尿病腎病的發病機制。

Murri等[21]對單純肥胖者與2型糖尿病伴肥胖者的脂肪組織進行對比研究，糖尿病患者谷胱甘肽S轉移酶μ2、過氧化物酶、抗凝血酶Ⅲ、載脂蛋白A-Ⅳ、免疫球蛋白κ鏈C區、線粒體醛脫氫酶和肌動蛋白豐度增加，膜聯蛋白-A1、醛脫氫酶1、黏著斑蛋白豐度下降，這些蛋白參與了細胞骨架的功能和結構、氧化應激、炎癥和類視黃醇代謝，將來在2型糖尿病的發展以及功能障礙的研究中，這些蛋白質可以發揮候選分子的作用。Hwang等[22]分析正常人、單純肥胖患者以及2型糖尿病患者的骨骼肌蛋白質，結果顯示92個蛋白點與胰島素抵抗有關，其中15個點具有明顯的豐度變化，如TCP-1亞基、蛋白水解酶復合體水平增加，結蛋白和α輔肌動蛋白2水平下降，結果證實在胰島素抵抗的肌肉中線粒體數量減少，蛋白質降解，肌肉結構改變。

2.3.2 血液中的蛋白質組學研究 Takahashi等[23]利用iTRAQ技術，對2型糖尿病KK-Ay鼠血清進行研究，確定了8種蛋白存在變化，其中補體因子B、載脂蛋白A-Ⅱ、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K(Serpina3k)、血纖維蛋白溶酶原等水平明顯升高。在體外實驗發現，人類視網膜微血管同源性Serpina3k能夠增加跨內皮通透性，這可能與糖尿病和/或糖尿病視網膜病變的發病機制相關。

Lu等[24]比較確診時間少于5年且合并視網膜病變的2型糖尿病患者與確診時間超過10年但未出現視網膜病變的2型糖尿病患者的血清蛋白質組，確定了77個血漿差異蛋白，其代表28個獨特的基因產物，其中生育酚結合蛋白(afamin)、α1-抗胰蛋白酶、載脂蛋白E、結合珠蛋白等水平下降；抗凝血酶Ⅲ、纖維蛋白原α、激肽原1、鋅-α-2-糖蛋白等水平上升，這些蛋白質主要參與炎性反應和凝血作用。作者認為利用該方法確定的幾個蛋白質可以作為潛在的糖尿病性視網膜病的生物標志物，與糖尿病的進展有關。

2.3.3 其他體液中的蛋白質組學研究 Zürbig等[25]運用毛細管電泳-電荷耦合質譜法分析了正常人、新發糖尿病及糖尿病腎病進展期患者尿中的低分子量蛋白質，結果顯示膠原蛋白片段、免疫球蛋白受體聚合、CD99抗原、尿調節素(在內質網中產生，最后通過蛋白酶水解切割釋放到尿液中，能夠阻礙腎結石和尿路感染發生)等在糖尿病腎病進展期患者的尿液中水平均下降，間接證明上述蛋白與糖尿病腎病的發生發展有關，可以作為預測糖尿病腎病的生物標志物，在早期階段通過非侵入性方法對糖尿病腎病進行風險評估。Riaz等[26]收集了100例性別相同、年齡相似、病情發展程度相當的2型糖尿病患者及正常對照組的尿樣，運用二維分析液相色譜儀(一維色譜聚焦，二維反相色譜法)和MS發現2型糖尿病患者中轉甲狀腺素蛋白、人α1微球蛋白/bikunin前體蛋白、結合珠蛋白前體水平減少；清蛋白、鋅-α-2-糖蛋白、視黃醇結合蛋白4、人鈣黏附蛋白水平下降，上述蛋白的發現不僅在早期診斷，而且在評估2型糖尿病的預后方面都將有幫助。Paasch等[27]收集1型糖尿病患者、2型糖尿病患者、單純肥胖患者和健康人的精液，對其中的精子細胞運用2-DE進行分析，結果顯示與健康人相比，其他3組共有79個蛋白點存在明顯變化。MS鑒定，1型糖尿病組有12種蛋白水平發生變化，2型糖尿病組有71種，單純肥胖組有13種。1型糖尿病組和2型糖尿病組精囊蛋白、簇集蛋白、乳鐵蛋白顯著增加；β-半乳糖苷酶-1樣蛋白是惟一的在3個病理情況下均被檢測到下降的蛋白質，前3種蛋白質是附睪蛋白酶(EPPIN)抑制劑復合物的組成部分。EPPIN被認為具有完成受精相關的功能作用，如射精、精子的保護，運動能力的調節和增強頂體反應；β-半乳糖苷酶-1樣蛋白作為糖基水解酶蛋白質，其功能與精子成熟有關。

3 現狀與展望

使用2-DE凝膠技術為基礎的方法對蛋白質進行研究已經廣泛開展，其缺點為研究結果的重現性和敏感度有限。MS敏感度高，可靠性強，但是不適宜大量蛋白質的快速鑒別[28]。此外，對于肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病系列的蛋白質組學研究仍存在局限性，目前的研究幾乎都僅限于篩選差異蛋白質，而功能研究還不是很深入，對各種差異蛋白相互作用的研究更少。

未來對肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病系列的蛋白質組學研究主要在以下幾方面存在挑戰：(1)豐度極低的蛋白質變化非常小，當前的蛋白質組學工具很難檢測到。但這些低豐度蛋白質或小的變化，可能對維持細胞正常功能起到非常關鍵的作用，也可能是關鍵的功能調控機制。(2)信息快速調節蛋白的分泌和信號轉導調控是一個動態過程，甚至是一過性的，及時地針對性蛋白動態捕捉技術仍有待研究。(3)多種蛋白質作為一組蛋白的貢獻是相互關聯的，對其進行系統研究能夠更好地理解作為一個功能整體對健康和疾病的影響。(4)就目前來看，研究的成本過于昂貴。

對于糖尿病，可以在細致分類的基礎上進行有無差異蛋白-差異蛋白鑒定-蛋白功能、相互作用及影響-藥物靶向治療的縱向研究，揭示這些蛋白質在2型糖尿病發病過程中扮演的角色，為了解2型糖尿病的發病機制、鑒定疾病的分子標志物、針對性治療提供新的途徑和思路。

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