舒郁膠囊及主要組份對(duì)PMS肝氣郁證大鼠海馬中CACNA1C蛋白表達(dá)和功能的影響

宋春紅，李 芳，郭英慧，張惠云

（山東中醫(yī)藥大學(xué)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3.科技處，山東 濟(jì)南 250355；4.北京豐臺(tái)婦幼保健醫(yī)院藥劑科，北京 100069）

CACNA1C基因編碼L型鈣通道α1C亞基，其基因多態(tài)性與多種情感障礙類(lèi)疾病如精神分裂癥和重度抑郁等發(fā)生有關(guān)［1］。經(jīng)前期綜合征（premenstrual syndrome，PMS）發(fā)生的易感神經(jīng)生物學(xué)因子與重度抑郁癥相似［2］，該基因與 PMS的關(guān)系如何？尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究從PMS肝氣郁證入手，以舒郁膠囊及主要組份進(jìn)行藥物干預(yù)，采用Western blot和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，探索CACNA1C與PMS肝氣郁證的關(guān)系和舒郁膠囊的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，體質(zhì)量140-160 g，♀，Wistar新生鼠，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（魯）2011-0003］。

1.2 藥品與主要試劑 舒郁膠囊、柴胡提取物和白芍提取物（青島陽(yáng)光海川醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2011L06107、20110526和20110527）；氟西汀（禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)H20050463）；尼莫地平（德國(guó)拜爾醫(yī)藥保健有限公司：北京，批號(hào)：H20003010）。CACNA1C一抗（ab58552，abcam）；山羊抗兔二抗（SB200，遠(yuǎn)達(dá)晶美）。

1．3 PMS肝氣郁證大鼠模型復(fù)制及給藥 利用慢性束縛應(yīng)激法制備模型［3］，根據(jù)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基線(xiàn)期數(shù)據(jù)將大鼠分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組（生理鹽水，5 ml·kg-1）、PMS肝氣郁證模型組（生理鹽水，5ml·kg-1）、舒郁膠囊組（0.41 g·kg-1）、柴胡提取物組（0.32 g·kg-1）、白芍提取物組（0.036 g·kg-1）、氟西汀 +尼莫地平組（2.7 mg·kg-1）。給藥與人當(dāng)量，每天灌胃1次。連續(xù)5 d。造模完成后，分離血清并迅速剝離海馬備用。

1．4 Western blot檢測(cè)CACNA1C蛋白表達(dá) 按 RIPA方法提取海馬腦區(qū)總蛋白。以50μg總蛋白每泳道上樣，SDSPAGE電泳分離蛋白，ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)雜交信號(hào)，用掃描儀對(duì)X光片進(jìn)行灰度掃描，采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰密度分析。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn) 各組大鼠血清孵育原代大鼠海馬神經(jīng)元，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)L型鈣通道電流密度（由北京愛(ài)思益普生物科技股份有限公司提供技術(shù)服務(wù)）。

1.6 數(shù)據(jù)分析 利用GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析。

2 結(jié)果

2．1 PMS肝氣郁證大鼠海馬中CACNA1C蛋白的表達(dá)量與正常組相比，各組大鼠海馬中蛋白表達(dá)量差別無(wú)顯著性（P＞0.05）。

2．2 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞L型鈣通道鈣電流密度 與正常組相比，模型組大鼠血清孵育后細(xì)胞內(nèi)L型鈣電流密度明顯升高（P＜0.05），各給藥組大鼠血清孵育的細(xì)胞L型鈣電流密度差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

3 討論

本研究從CACNA1C蛋白表達(dá)和功能兩個(gè)方面對(duì)其與PMS肝氣郁證的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CACNA1C蛋白在各組大鼠海馬中表達(dá)差異無(wú)顯著性，但是模型組大鼠血清孵育的海馬神經(jīng)元L型鈣電流密度明顯升高，藥物干預(yù)組大鼠血清孵育的海馬神經(jīng)元差別無(wú)顯著性。有研究發(fā)現(xiàn)，CACNA1C雜合基因敲除小鼠可以改變抑郁狀的表型，同時(shí)L型鈣通道蛋白表達(dá)水平降低和LTCC通道電流減少［4］。但是本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有在蛋白水平發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異，很可能與模型復(fù)制所需時(shí)間短有關(guān)；而體外試驗(yàn)結(jié)果表明LTCC通道電流增加可能與PMS肝氣郁證的發(fā)生有關(guān)。雌激素和芍藥苷均可阻斷L型鈣通道［6-7］，柴胡皂苷d有類(lèi)似雌激素的作用，因此我們推測(cè)舒郁膠囊和其主要組分柴胡和白芍提取物可能作為L(zhǎng)型鈣通道的拮抗劑，但是對(duì)其具體作用微觀機(jī)制我們還將進(jìn)一步證實(shí)和深入研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Bhat S，Dao D T，Terrillion C E，et al.CACNA1C（Cav1.2）in the pathophysiology of psychiatric disease［J］.Progr Neurobiol，2012，99（1）：1-14.

［2］ Gingnell M，Comasco E，Oreland L，et al.Neuroticism-related personality traits are related to symptom severity in patients with premenstrual dysphoric disorder and to the serotonin transporter gene-linked polymorphism 5-HTTPLPR［J］.Arch Women′smental health，2010，13（5）：417-23.

［3］ 魏 盛，王海蘋(píng)，喬明琦.慢性束縛應(yīng)激及居住入侵法制備經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型的行為學(xué)觀測(cè)與分析［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14（4）：1848-52.

［3］ Wei S，Wang H P，Qiao M Q.Behavioral observation and analysis of PMS liver-qi depression rat model established by chronic restraint stress and resident-intruder paradigm［J］.World Sci Technol Modernizat Tradit Chin Med，2012，14（4）：1848-52.

［4］ Dao D T，Mahon P B，Cai X，et al.Mood disorder susceptibility gene CACNA1Cmodifiesmood-related behaviors inmice and interactswith sex to influence behavior inmice and diagnosis in humans［J］.Biol Psych，2010，68（9）：801-10.

［5］ Cairr?o E，Alvarez E，Carvas JM，et al.Non-genomic vasorelaxant effects of17β-estradiol and progesterone in rataorta aremediated by L-type Ca2+current inhibition［J］.Acta Pharmacol Sin，2012，33（5）：615-24.

［6］ 張廣欽，郝雪梅，陳世忠，等.芍藥苷對(duì)大鼠心肌細(xì)胞 L鈣通道的阻斷作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（8）：863-6.

［6］ Zhang G Q，He X M，Chen SZ，etal.Blockade of paeoniflorin on L-type calcium channel in isolated rat ventricular myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19（8）：863-6.

［7］ Wang P.Estrogen-like activities of saikosaponin-d in vitro：A pilot study［J］.Eur JPharmacol，2010，626（2）：159-65.