枯草芽孢桿菌產酶活性改良研究進展

和小黑，張文舉，魏曉燕

（石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是當今酶生產中應用最廣泛的菌種之一，據不完全統計，枯草芽孢桿菌所產的酶占整個酶市場的50%。由于枯草芽孢桿菌具有產酶量高、種類多、安全性好和環保等優點，其在現代酶制劑生產中被廣泛應用。枯草芽孢桿菌發酵生產的酶類已經在飼料、食品、紡織等領域發揮著重要的作用。一般自然界中存在的野生型菌株產酶量普遍較低，且酶的穩定性較差，如何提高菌株的產酶性能是普遍關心問題。因而培育、誘變、基因工程等技術不斷地被研究者們用來嘗試提高菌株的產酶性能。

1 枯草芽孢桿菌所產酶類

枯草芽孢桿菌是一類廣泛分布于不同生活環境中的革蘭氏陽性桿狀好氧型細菌，在土壤和植物的表面普遍存在。菌體在生長過程中能產生多種活性物質，其中就包括多種酶類。研究表明，枯草芽孢桿菌能分泌植酸酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶等十幾種酶類（David等，1997）。這些活性酶能降解植物飼料中非淀粉多糖和大分子蛋白，提高飼料中營養成分的消化利用率，還可以補充動物內源酶的不足，從而促進動物的生長、提高生產性能（王振華，2008）。

2 枯草芽孢桿菌產酶活性改良法

2.1 微生物培養法

2.1.1 液體發酵條件改良法 枯草芽孢桿菌的生長環境會嚴重影響其產酶性能。培養基中的營養成分能改善枯草芽孢桿菌的生長狀態，調控細胞內特定的代謝途徑，從而提高酶的產量和活性。其中碳源和氮源對菌株產酶活性的影響最大，選擇合適的碳源和氮源也顯得尤為重要。常見作為碳源的物質有葡萄糖、淀粉、蔗糖等，常見的氮源有尿素、豆粉、蛋白胨等。同時發酵溫度、接種量、初始pH值、發酵時間等也對其產酶性能有較大影響。全桂靜和尹黎獻（2011）對選育的高產低溫堿性蛋白酶枯草芽孢桿菌發酵條件進行了優化研究，發現發酵條件為葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉 3 g/L，pH 8.0，接種量 5%，裝液量 20 mL（50 mL三角瓶），30℃發酵28 h時，酶活力最高，達2231 U/mL。Irfan等（2012）對產木聚糖酶枯草芽孢桿菌BS05深層發酵進行研究，發現靜置發酵時，使用底物為米糠，碳源為蔗糖，氮源為酵母膏，發酵溫度為37℃，發酵72 h時木聚糖酶活力最高，達到408 U/mL；在攪拌發酵時以甘蔗渣為底物在同樣培養基條件下，轉速為140 r/min，37℃發酵48 h，木聚糖酶活力最高，達439 U/mL。此外，研究者分別對枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶（黃璠和蔡俊，2012）、淀粉酶（Poddar等，2012）、纖溶酶 （陳桂光等，2012）、 植酸酶 （Kammoun等，2012）、β-半乳糖苷酶（崔福綿等，1999）、纖維素酶（Deka等，2011）等的發酵條件進行優化均能不同程度地提高酶活性。

2.1.2 固體發酵條件改良法 固態發酵培養基質簡單且來源廣泛，多為便宜的天然基質或工農業副、廢產品，如麩皮、薯粉、棉粕、大豆餅粉、高粱、玉米粉等，經發酵后不僅可以增加產酶量，還可以消除部分抗營養因子、改善蛋白質品質等，從而提高飼料的利用率。由于固體發酵過程中無廢水、廢氣產生，與液體發酵相比減少了脫水、干燥等能源的大量耗費，故污染少、能耗低、技術較簡單，因而得到廣泛的應用（Elbendary，2006）。固體發酵產酶活性的大小主要受發酵底物、底物初水分、接種量、發酵溫度、發酵時間、初始pH值等因素的影響。許多研究表明，對枯草芽孢桿菌的固體發酵條件進行改良也可以提高枯草芽孢桿菌酶的活性。Khandeparker等（2011）用海洋細菌枯草芽孢桿菌cho40發酵麥麩，研究發現在pH 6.0、發酵溫度60℃時，木聚糖酶的活性達到最高。吳暉等（2008）研究了枯草芽孢桿菌固態發酵豆粕的不同發酵條件對發酵豆粕中蛋白酶活力的影響，結果表明在料水比1∶1 （V/V）、pH 7.0、 接種量 4%、30 ℃發酵 72 h條件下發酵豆粕，底物中蛋白酶活力最高，達到630 U/g。董緒燕等（2008）采用LB培養基活化的枯草芽孢桿菌發酵菜籽餅，發酵初始pH 7.0，發酵時間24 h條件下得到的溶栓酶其活性提高到83.32 U/g。 Huzairy 和 Khairiah（2012）分別以油棕櫚殼和稻秸為底物，比較發酵后枯草芽孢桿菌產α-淀粉酶的活力，并對其發酵溫度、發酵時間進行優化，結果表明以稻秸為底物發酵產α-淀粉酶活力高于油棕櫚殼，達到276 U/g。Unakal等（2012）用產α-淀粉酶枯草芽孢桿菌發酵香蕉皮，對發酵時間、溫度、pH值進行優化，α-淀粉酶的活力提高到7.93 U/mL·min。

2.2 枯草芽孢桿菌菌株基因改造法

2.2.1 誘變育種 隨著對遺傳變異現象認識的深入，出現了通過誘變劑提高誘變頻率的育種技術。誘變育種技術是通過物理、化學技術人為地使其遺傳物質發生變異，從中選育高產菌株。該技術具有操作簡便、速度快、收效大等優點，而且誘變手段多樣，所以是實驗室及生產上最為常用的高產菌株的育種方式。常見的誘變方法有：激光、X-射線、Y-射線快中子、紫外線（UV）、亞硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）等。利用誘變的方法提高枯草芽孢桿菌的產酶性能，國內外已經有不少成功的報道。在化學誘變方面，孫金鳳等（2008）研究表明，經硫酸二乙酯（DES）誘變處理 50 min后，篩選得到的枯草芽孢桿菌突變株 DES-4其殼聚糖酶活是原菌株的 2.7倍。Chand等（2004）用溴乙錠和NTG復合誘變，選育出突變菌株CMV5-A10，其濾紙酶活、羧甲基纖維素（CMC）酶活分別是野生菌的2.2和2.1倍。在物理誘變方面，謝鳳行等（2009）采用紫外誘變的方法對枯草芽孢桿菌H4和H5進行連續誘變篩選產淀粉酶高的突變株。結果發現，第一次誘變后突變株的酶活分別為原始菌株的107%和111%；經過第二次誘變后，H4的突變株H4Ⅱa，H5的突變株H5Ⅱa和H5Ⅱb的產酶能力有很大程度的提高，分別為原始菌株的147%、136%和135%，說明紫外連續誘變有利于突變株產酶能力的提高。宋鵬等（2011）以產復合酶枯草芽孢桿菌QLB6為出發菌株，利用氦-氖（He-Ne）激光進行誘變育種，獲得1株編號為QLB6F的菌株，其纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活力較出發菌株分別提高219%、38%和71%。

目前也有學者將化學誘變與物理誘變相結合，也得到良好的效果。李然等（2008）從小麥根際土壤中分離到一株對多種植物病原真菌有拮抗作用且產蛋白酶的枯草芽孢桿菌T2，經UV和DES誘變處理，獲得具有良好遺傳穩定性的蛋白酶正負突變株。與出發菌株相比，培養48 h的正突變株胞外蛋白酶活力提高108.5%，負突變株蛋白酶活力降低81.1%。Zhang（2012）通過UV和亞硝酸鈉溶液復合誘變枯草芽孢桿菌，突變菌株經發酵后角蛋白酶活力提高了75.9%。

2.2.2 基因工程法 隨著現代分子生物技術的飛速發展，基因工程為菌種產酶性能改良開辟了一條新途徑。該方法主要是對菌株的產酶基因進行改造，從而改善其產酶活性，是提高枯草芽孢桿菌產酶性能的一種便捷、有效的方法。它實現了超遠緣雜交，是一種最新最有前途的育種方法。

目前，在國內外通過基因工程方法來提高產酶性能已經有許多成功的例子。馬磊等（2005）用枯草桿菌強啟動子P43構建了大腸桿菌-枯草桿菌穿梭表達載體pYG43，利用這種載體表達枯草桿菌纖維素酶產量比原宿主菌（B.subtilis1A747）提高了5～7倍。Kim等（2000）利用DNA改組融合技術，在大腸桿菌中表達使得枯草桿菌內切酶突變體的活性提高5倍。Liu等 （2012）將枯草芽孢桿菌TCCC11286的堿性果膠酶基因進行克隆，將果膠酶基因插入表達載體pWB980構成重組質粒pWB-Apel，然后將該重組質粒導入枯草芽孢桿菌WB600，在50℃、pH 9.0時經搖床發酵后酶的活力高達445 U/mg。Guan等（2013）將枯草芽孢桿菌X1漆酶基因進行克隆并在大腸桿菌中進行表達，研究發現漆酶在堿性和高溫條件下仍具有較好酶活力。

2.3 添加化學因子的方法

2.3.1 金屬離子對產酶活性的影響 枯草芽孢桿菌所產酶的活性也受到一些金屬離子的影響。金屬離子能以不同的方式與底物、酶的活性產物和酶本身產生極強的親和力，從而導致酶活性的改變。有些離子能對酶活性產生抑制作用，有些則激發酶的催化功能。因而在培養基中適量添加一定濃度的具有激活酶催化作用的金屬離子，如Ca2+、Mg2+、Na+、K+等，能夠一定程度地提高枯草芽孢桿菌酶的活性。

2.3.2 非離子表面活性劑對產酶活性的影響 研究表明，非離子表面活性劑能夠提高酶的活性及穩定性，其主要原因可能是因為這些分子提高了酶對營養物質的結合性，從而提高催化效果。目前對非離子表面活性劑的應用很多，然而促進枯草芽孢桿菌酶活性的報道較少。Poddar等（2012）對產耐高溫β-淀粉酶枯草芽孢桿菌DJ5的產酶條件進行研究，發現在培養基中添加0.03%的賴氨酸能夠顯著的提高β-淀粉酶的活力。Evan和Abdullahi（2012）研究表明，在產蛋白酶枯草芽孢桿菌培養基中添加吐溫-80，可以使蛋白酶的活力提高5倍，同時也提高了蛋白酶的熱穩定性。

3 枯草芽孢桿菌產酶活性改良方法的優缺點

枯草芽孢桿菌產酶性能改良技術目前已取得了令人矚目的成就，但其發展過程中仍存在不少問題。通過培養條件改良法來提高酶活力雖有效，但僅改善了枯草芽孢桿菌生長的外部環境，菌株本身的產酶能力并沒有改善，因而提高能力有限。誘變育種方法盡管可以獲得酶活性較高的突變株，但其穩定性較差，并且誘變后可能會出現正、負突變，有很大的盲目性，而且基因變異的程度也有限，進一步提高酶活性受到了限制。所以要獲得酶活性提高很大的突變株，仍需進行大量的誘變篩選工作，才有望獲得更為理想的穩定的突變株 （潘風光等，2005）。基因工程技術是目前最有效的提高產酶性能的方法，具有目的性和直接性。但其操作復雜，技術還不夠成熟，目前仍處于探索階段。向培養基中添加金屬離子或表面活性劑能顯著提高枯草芽孢桿菌產酶活性，操作簡便，效果顯著。然而其作用機理尚未明確，仍需要進一步研究。

4 展望

目前，枯草芽孢桿菌酶已是酶市場的主體，如何快速、有效地提高產酶的活性，以滿足市場的需求，是亟待解決的問題。雖然目前對枯草芽孢桿菌產酶活性的改良技術已取得一定的成績，但效果并不理想，而且技術方面也存在著許多問題。相信隨著科技的發展，基因工程、現代分子生物技術的進步，有望篩選出更高產酶活性的枯草芽孢桿菌菌株，同時隨著酶制劑在各領域的廣泛應用，低成本、大規模的酶生產將成為今后酶工業發展的趨勢，因此，酶制劑的開發具有廣闊的市場前景和應用價值。

[1]陳桂光，李文杰，黃梅華，等.產纖溶酶海洋枯草芽孢桿菌的發酵工藝研究[J].食品工業科技，2012，24（33）：249 ～ 252.

[2]崔福綿，石家驥，魯茁壯.枯草芽孢桿菌中性β-甘露聚糖酶的產生及性質[J].微生物學報，1999，39（1）：60 ～ 63.

[3]董緒燕，胡小加，江木蘭，等.采用枯草芽孢桿菌發酵菜籽餅粕生產溶栓酶條件的優化[J].中國油料作物學報，2008，30（2）：239 ～ 241.

[4]高永生，朱麗云，朱貴州，等.枯草芽孢桿菌產酶規律及酶學性質研究[J].安徽農業科學，2011，39（19）：11964 ～ 11965.

[5]黃璠，蔡俊.枯草芽孢桿菌產中性蛋白酶的發酵條件優化[J].飼料工業，2012，33（2）：49 ～ 51.

[6]李然，邢介帥，韓立英，等.枯草芽孢桿菌胞外蛋白酶突變株的篩選及其拮抗作用[J].應用與環境生物學報，2008，14（2）：231 ～ 234.

[7]馬磊，蔡勇，楊明明，等.穿梭表達載體pYG43的構建及堿性纖維素酶基因的分泌表達[J].安徽農業科學，2005，33（3）：448 ～ 450.

[8]潘風光，柳增善，劉海學，等.地衣芽孢桿菌耐高溫α-淀粉酶基因工程菌的研究進展[J].內蒙古民族大學學報，2005，20（2）：60 ～ 63.

[9]全桂靜，尹黎獻.低溫堿性蛋白酶高產菌株的選育與發酵條件研究[J].沈陽化工大學學報，2011，25（2）：117 ～ 120.

[10]宋鵬，黃亮，陳亮.產復合酶枯草芽孢桿菌QLB6的激光誘變育種[J].食品科學，2011，32（9）：222 ～ 224.

[11]孫金鳳，吳薇，潘翔.產殼聚糖酶菌株的分離篩選及其誘變育種[J].工業微生物，2008，2：56～ 59.

[12]王振華.高產酶活枯草芽孢桿菌制劑在奶牛生產上的應用研究[J].安徽農業科學，2008，36（27）：11771 ～ 11773.

[13]吳暉，卓林霞，解檢清，等.發酵條件對枯草芽孢桿菌發酵豆粕中的蛋白酶活力的影響[J].現代食品科技，2008，24（10）：973 ～ 976.

[14]謝鳳行，趙玉潔，周可，等.產胞外淀粉酶枯草芽孢桿菌的分離篩選及其紫外誘變育種[J].華北農學報，2009，24（3）：78 ～ 82.

[15]Chand P，Aruna A，Maqsood A M，et al.Novel mutation methodfor increased cellulose production[J].The Society for Applied Microbiolgy，2004，98：318～323.

[16]David J，Gary N，Owens K，et al.Formation of Volatile Compounds During Fermentation of Soya Beans Bacillus Subtilis[J].Journal Science of Food A-griculture，1997，74（8）：132 ～ 140.

[17]Deka D，Bhargavi P，Sharma A，et al.Enhancement of Cellulase Activity from a New Strain of Bacillus subtilis by Medium Optimization and Analysis with Various Cellulosic Substrates[J].Enzyme research，2011，2011：151656.

[18]Elbendary M A.Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus biopesticides Production[J].Basic Microbiol，2006，46：158 ～ 170.

[19]Evans E C，Abdullahi A.Effect of surfactant inclusions on the yeld and characteristics of protease from Bacillus Subtilis[J].Proc Rom Acad Series B，2012，2：108 ～ 112.

[20]Guan Z B，Zhang N，Song C M，et al.Molecular Cloning，Characterization，and Dye-Decolorizing Ability of a Laccase from Bacillus subtilis X1[J].Applied biochemistry and bio technology，2013.1 ～ 11.

[21]Huzairy H，Khairiah A K.Utilization of Agricultural By-Products for Alpha-Amylase Production under Solid State Fermentation by Bacillus subtilis[J].Engineering Journal，2012，16（5）：177.

[22]Irfan M，Nadeem M，Syed Q，et al.Effect of Medium Composition on Xylanase Production by Bacillus subtilis using Various Agricultural Wastes[J].American-Eurasian Agric&Environ Sci，2012，12（5）：561 ～ 565.

[23]Kammoun R，Farhat A，Chouayekh H，et al.Phytase production by Bacillus subtilis US417 in submerged and solid state fermentations[J].Ann Microbiol，2012，62：155 ～ 164.

[24]Khandeparker R，Verma P，Deobagkar D.A novel halotolerant xylanase from marine isolate Bacillus subtilis cho40：gene cloning and sequencing[J].N Biotechnol.2011，28（6）：814 ～ 821.

[25]Kim Y S，Jung H C，Pan J G.Bacterial cell surface display ofan enzyme library for selective screening of improved cellulasevariants[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（2）：788 ～ 793.

[26]Liu Y H，Chen G Q，Wang J L，et al.Efficient expression of an alkaline pectate lyase gene from Bacillus subtilis and the characterization of the recombinant protein[J].Biotechnol Lett，2012，34：109 ～ 115.

[27]Poddar A，Gachhui R，Jana S C.Optimization of physico-chemical condition for improved production of hyperthermostable β-amylase from Bacillus subtilis DJ5[J].Biochem Tech，2012，3（4）：370 ～ 374.

[28]Unakal C，Kallur R I，Kaliwal B B.Production of α-amylase using banana waste by Bacillus subtilis under solid state fermentation.Euro[J].Exp Bio，2012，2（4）：1044 ～ 1052.

[29]Zhang X.Applying the mutation of Bacillus subtilis and the optimization of feather fermentation medium to improve Keratinase activity[J].Advances in Biological Chemistry，2012，2：64 ～ 69.■