歐洲食品安全局動物飼料添加劑和飼料產品委員會關于動物營養中屎腸球菌的安全性評估指南

中國飼料工業協會 王黎文 譯

1 前言

眾所周知，腸球菌是胃腸道的人畜共生菌，與許多動物一樣，多數人群一般都會攜帶。人類腸球菌感染包括心內膜炎、尿路感染以及由糞便微生物污染造成的腹腔或盆腔感染（Murray，2000），但感染發生在醫院等醫療機構之外的病例極為罕見。

在當今醫療機構中，腸球菌菌株通常是從感染病例分離回收獲得。第一次大范圍的與醫院有關的腸球菌感染 （主要是糞腸球菌）是在20世紀80年代伴隨對廣譜頭孢菌素的使用（腸球菌對其有抗性）以及免疫系統受損病人數量的增加而產生，這也是腸球菌感染的主要原因。廣譜頭孢菌素殺死了胃腸道中的大多數固有微生物，但由于腸球菌對其具有抗性而存活下來。因此，腸球菌菌群存在于大多數住院病人的腸道內，且數量巨大。植入導管、免疫抑制以及化療導致的黏膜發炎等影響因素改變了以往宿主的菌群平衡，進而促進了菌體感染的發生?；颊叩目股厥褂盟坪跏且l可控共生菌感染的關鍵因素（Ubeda 等，2010；Murray，2000）。

在20世紀90年代初，醫療機構臨床分離得到的腸球菌中，90%～95%為糞腸球菌，僅有5%為屎腸球菌。在過去的15～20年中，美國從醫療機構感染區域分離得到的屎腸球菌已經明顯增多，目前大約已占35%。與此同時，相對于社區環境中發現的屎腸球菌而言，源于醫療機構的屎腸球菌分離株對氨芐青霉素和哌拉西林具有更為普遍的抗性。在美國還發現，這一具有氨芐青霉素抗性的屎腸球菌對萬古霉素也具有抗性。目前，70%來自美國醫療機構的屎腸球菌分離株具有萬古霉素抗性，而90%具有氨芐青霉素抗性。相反，僅1%～5%的糞腸球菌對這兩種抗生素具有抗性，這可能是醫療機構中屎腸球菌相對于糞腸球菌增多的原因，即主要是由于頻繁使用對糞腸球菌有抑制作用的抗生素所導致的 （Bertics等，2009；Hidron 等，2008）。

在歐盟，具有萬古霉素抗性的屎腸球菌菌株（VER）是在20世紀80年代首次被檢出，這些菌株是從使用糖肽阿伏霉素的養殖場動物的糞便中分離得到的，其中大多數是氨芐青霉素敏感菌株。從動物源性食品和健康人群的糞樣中也分離得到了屎腸球菌菌株。然而，上述屎腸球菌菌株在醫院之外的感染很少見。最近，在歐盟的住院患者中已經發現了具有氨芐青霉素抗性的屎腸球菌，其中部分像早些時候在美國一樣，也已經獲得了萬古霉素的抗性，而且在醫療機構中的感染頻率正在上升，現在占到醫院腸球菌感染的40%～50% （Werner 等 ，2008；Top 等 ，2007；Leavis等，2003；Bonten 等，2001）。

目前已經認可屎腸球菌由兩個不同的亞種或分支組成，并且分支可能早在成千上萬年前就已經形成。這些分支可以通過多位點序列分型（MLST）來區分，即通過共有核心基因的序列比對、是否含有IS16插入序列和其他獲得元件，以及是否具有對氨芐青霉素的抗性來判定菌種屬于哪個分支。其中一個亞種（2012年Palmer等根據全基因組系統發生法將其稱為B分支）主要是從健康人群糞便中分離得到的，且對氨芐青霉素敏感；另一個亞種（A分支）包括多數醫療機構臨床分離的具有氨芐青霉素抗性的菌株 （Palmer等，2012；Galloway-P en～a 等 ，2011；Willems 和 van Schaik，2009；Leavis等，2007），同時，A 分支也包括具有氨芐青霉素抗性的來自于狗的分離菌株（De Regt等，2012）。 根據MLST數據進行菌群遺傳分析后預測，源于養殖動物的氨芐青霉素敏感菌株也將歸至A分支。

2 屎腸球菌的系統發育學和基因組學

屎腸球菌的進化關系分析大多采用MLST法，該方法中等位基因圖譜依據7個看家基因序列而測定 （Homan等，2002）。第一個關于屎腸球菌種群結構的MLST研究是針對全球范圍收集的人類來源（醫院和社區分離的）和非人類來源（動物和環境中分離的）屎腸球菌菌株進行的表征研究，同時定義了175個序列類型 （STs）。用e-BURST軟件對序列類型進行分組，將任意大小的MLST數據集分解成與分離株相關或與克隆復合體（CCs）相關的數據組，并預測每一個CC的起源基因型。該項研究表明，全球大多數醫院分離的代表性菌株，其基因型和進化史關系都十分相近，同屬于某一CC，該CC被命名為CC17（Willems等， 2005）。

然而，根據當前MLST數據庫（http://efaecium.mlst.net/）中所有有效的STs并利用eBURST軟件所推測出來的屎腸球菌的菌群結構，是一個龐大的CC，包括先前命名的CC17，同時也包括次要的CC和序列。該數據庫涵蓋了69%的屎腸球菌的STs（Willems等，2011）。這些發現和基因組基礎研究表明，從醫院分離得到的屎腸球菌并不是最近才從單一的共同祖先進化而來（van Schaik等，2010），因此，最初確定CC17為醫院屎腸球菌的CC很有可能是錯誤的。

相反，從醫院分離得到的菌株構成了一個多克隆屎腸球菌亞種，且具有明顯的進化克隆體（Willems 等，2011；Willems 和 van Schaik，2009）。比較基因組雜交和基因組測序發現，屎腸球菌臨床分離株富含某幾個基因，其中最具代表性的就是 IS16插入序列 （van Werner等，2011；Schaik等，2010；Leavis等，2007）， 該基因可能賦予了屎腸球菌對其宿主一定程度的基因組適應性，從而促進其獲得與毒性或與抗生素抗性相關的額外基因元件。

MLST和基因組測序同時還揭示了來源于健康人群的菌株呈現一個明顯的區分簇 （Zhang等，2011；van Schaik 和 Willems，2010）。 這些菌株可能已經適應了哺乳動物共生菌的生活。Galloway-Pen～a等（2011）也鑒定了屎腸球菌兩個主要亞種之間的區別，并以其對氨芐青霉素的抗性進行表征。

3 氨芐青霉素抗性

事實上，從醫院感染患者分離得到的大多數屎腸球菌菌株屬于同一個分支，且與另一個分支明顯不同，兩個分支內在本質的區別可能能夠解釋其不同的感染情況。區別之一就是從醫院分離菌株具有氨芐青霉素抗性（MICs>128 mg/L），并引發菌株產生對哌拉西林的交互抗性以及對頭孢菌素的高度抗性。在經常使用萬古霉素、頭孢菌素和哌拉西林的醫院中，耐藥菌所具有的β-內酰胺類藥物抗性和萬古霉素的抗性為其提供了選擇優勢（Murray，2000）。

此外，當腸道中革蘭氏陰性細菌被抗生素抑制時，抗腸球菌宿主的凝集素RegIIIγ的負調節作用使得腸球菌得以增殖（Brandl等，2008）。

細胞壁合成酶通常被認為是青霉素結合蛋白質（PBPs），這是因為青霉素通過結合這些蛋白質，以削弱其細胞壁合成功能來抑制細胞壁的形成。PBP5是一種屎腸球菌細胞壁合成酶，其蛋白質的編碼基因是屎腸球菌核心基因組的一部分。像屎腸球菌兩個分支的多數共有基因一樣，PBP5的編碼基因存在兩個等位基因，即pbp5-S和pbp5-R，二者的DNA序列有5%的差異。屎腸球菌中PBP5-S和PBP5-R的氨基酸序列差異是決定其是否具有氨芐青霉素抗性的主要因素。在已測序菌株中，從感染患者分離到的屎腸球菌菌株（分支A）具有pbp5-R基因，而社區健康人群中分離到的絕大多數屎腸球菌菌株（分支B）具有pbp5-S基因。進一步研究比較氨芐青霉素對每個菌株pbp5基因的最低抑菌濃度（MIC）發現，32株氨芐青霉素MIC>4 mg/L的屎腸球菌菌株都具有pbp5-R基因，氨芐青霉素MIC<4 mg/L的屎腸球菌菌株具有pbp5-S基因，而在氨芐青霉素MIC=4 mg/L的屎腸球菌菌株中，有的含pbp5-R基因，有的含pbp5-S基因。因此，氨芐青霉素MIC≤2 mg/L能夠準確地排除主要從病人處分離得到的菌株 （分支A），并排除胃腸道中對氨芐青霉素、阿莫西林或結構類似的抗生素可能有選擇性優勢的菌株（Galloway-等，2011；Rice等，2004）。

4 毒性因子和與醫院分離菌株有關的標記物

腸球菌已經被廣泛認為是條件致病菌，尤其是屎腸球菌，它是醫療機構中發現的幾乎唯一可引發感染的病原菌 （Willems和 van Schaik，2009）。很多可能與屎腸球菌毒性有關的因素已經被確認，但對于安全性評估，下列毒力因子和標記物與安全性最為相關：

4.1 IS16（醫院分離菌株標記物） IS因子是最簡單的轉座因子，只編碼對其轉位所必需的酶。腸球菌有大量的可移動遺傳元件，IS16可以在諸如Tn1547轉座子的側翼等位置被發現，該因子使屎腸球菌具有萬古霉素抗性。IS16是醫院分離的屎腸球菌亞種（分支A）的一個特殊的標記物，同時也是臨床糞腸球菌分離株的標記物 （Hegstad等，2010）。 Werner等（2011）研究發現，97%的血培養屎腸球菌菌株顯示IS16陽性，但是，僅4%的人畜共生菌菌株攜帶該因子。

4.2 Esp[致病島（PAI）標記物] Esp 是一個約200 kDa的屎腸球菌表面蛋白，通過LPxTG型基序與細胞壁以共價鍵連接 （Heikens等，2007；Leavis等，2004）。esp基因是一個大型致病島（60～100 kbp）的一部分，該島同時攜帶其活動基因（Top 等，2011；van Schaik 等，2010）。esp 基因在屎腸球菌生物膜的形成中發揮著重要作用（Heikens等，2007），并已有試驗證明esp基因能夠促使模型動物心內膜炎 （Heikens等，2011）和尿路感染（Leendertse等，2009）的發生。esp基因廣泛存在于具有氨芐青霉素和萬古霉素抗性的屎腸球菌分離株中（Vankerchoven 等，2004；Rice 等，2003）。

4.3 hyl-like基因 HylEfm最初被描述為一種透明質酸酶，但最近被認為是一種糖基水解酶。糖基水解酶可促進腸道細菌菌群的定植（Freitas等，2010）。來自社區分支的菌株幾乎不含hyl-like基因的大質粒，然而，醫院分離的菌株則通常具有該基因，比例約為30% （Rice等，2003）。hyl質粒已被證明能夠提高小鼠胃腸道細菌的定植能力，同時提高腹膜炎模型小鼠的死亡率，因此，對至少一部分來自醫院分支中的菌株的生長有促進作用（Panesso 等，2011；Rice 等，2009）。

5 評估

該評估的主要目的是將屬于醫院相關分支的菌株排除在動物營養中使用的屎腸球菌之外，原因在于消費者中的易感人群可能會受到其危害。

安全性評估之前，必須采用適當的分子學方法鑒定其確實屬于屎腸球菌，之后測定氨芐青霉素的最小抑菌濃度。

若MIC>2 mg/L，則該菌株被認為是不安全的，不應用作飼料添加劑。

若MIC≤2 mg/L，應檢測菌株是否含有IS16、hylEfm和esp遺傳元件（方法見附錄）。

若檢測不到三個遺傳元件中的任意一種，那么該菌株用作飼料添加劑使用則可以認為是安全的。

若檢測到三個遺傳元件中的一種或多種，那么該菌株則被認為是不安全的，不應用作飼料添加劑?！?/p>

附錄推薦方法

1 氨芐青霉素的MIC

測定氨芐青霉素的MIC時，應采用瓊脂或肉湯培養基并運用連續兩倍稀釋法，同時使用與之相關的質量控制菌株。測試應當按照國際公認的標準進行，如歐盟委員會的抗生素敏感性測試（EUCAST）、臨床實驗室標準化協會（CLSI）、國際標準化組織（ISO）等機構制定的標準或其他類似標準。菌體培養后，MIC被定義為抑制細菌生長的最低抗生素濃度。一般不允許采用定性或半定量方法來間接測定MIC，如擴散法。

2 醫院分離菌株相關的標記物檢測

如有可能，需要進行包括染色體和質粒在內的全基因組分析，來篩查是否存在IS16、esp和hyl基因。此外，也可以采用以下方法來分析：

2.1 IS16 推薦使用 Werner等（2011）的方法來檢測IS16，并使用以下PCR引物：IS16-F（正向）5'-CATGTTCCACGAACCAGAG 和 IS16-R（反向）5'-TCAAAAAGTGGGCTTGGC（屎腸球菌的目標片段預計為547 bp）。PCR分析應使用陽性和陰性對照菌株，屎腸球菌DSMZ 25390可作為陽性對照菌株，屎腸球菌DSMZ 25389可作為陰性對照菌株。

2.2 esp 檢測esp基因最好采用雜交技術，因為該方法很少依賴于引物結合位點的點突變，而點突變可導致假陰性結果。制備探針的引物為：esp14F （正向）5'-AATTGATTCTTTAGCATCTGG-3'和esp12R（反向）5'-AGATTTCATCTTTGATTCTTGG-3'（Leavis等， 2003）。 Hendrickx 等（2007）描述了用于Southern印跡的雜交條件，而Rice等（2003）和Hendrickx等（2007）描述了用于斑點印跡的雜交條件。菌落裂解物也可以用于雜交 （Singh等，1998）。雜交分析應使用陽性和陰性對照菌株，屎腸球菌DSMZ 25390可作為陽性對照菌株，屎腸球菌DSMZ 25389可作為陰性對照菌株。

2.3 hylEfm 推薦使用Rice等（2003）的方法來檢測hylEfm基因，采用以下PCR引物：5'-GAGTAGAGGAATATCTTAGC-3' （nt 856-nt 875）和反向引物hylEfm 5'-AGGCTCCAATTCTGT-3'（nt 1517-nt 1503）[屎 腸 球 菌 ATCC BAA-472（TX16）的目標片段預計為 661 bp]。

作為一種替代方法可以采用菌落裂解物雜交或 Southern印跡雜交法 （Rice等，2003；Singh等，1998）。基因探針的引物為：正向引物hylEfm（5'-GTT AGA AGA AGT CTG GAA ACC G-3'；nt 149-nt 170）， 反向引物hylEfm （5'-TGC TAA GAT ATT CCT CTA CTC G-3'；nt 876-nt 855）， 屎 腸 球 菌ATCC BAA-472（TX16）的目標片段預計為727 bp。

PCR和雜交技術應使用陽性和陰性對照菌株，屎腸球菌DSMZ 25390可作為陽性對照菌株，屎腸球菌DSMZ 25389可作為陰性對照菌株。