冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展

秦 鵬，趙玉卉，王 龍，2 *，路等學(xué)

（1.甘肅省科學(xué)院 生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

過(guò)去冬蟲(chóng)夏草一直被認(rèn)為麥角菌科（Clavicinitaccac）、蟲(chóng)草屬（Cordyceps）真菌，拉丁學(xué)名為Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.，近幾年有關(guān)研究從分子生物學(xué)角度證實(shí)冬蟲(chóng)夏草屬線蟲(chóng)草科（Ophiocordycipitaceae）、線蟲(chóng)草屬（Ophiocordyceps）真菌，合法名為Ophiocordyceps sinensis（Berk.），野生冬蟲(chóng)夏草為冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)后長(zhǎng)出的子座與僵蟲(chóng)體構(gòu)成的復(fù)合體，其具有抗腫瘤、抗病毒等功效[1]。目前，只有中國(guó)、布丹、尼泊爾和印度四個(gè)國(guó)家存在野生資源[2]，而其他國(guó)家分布野生冬蟲(chóng)夏草的報(bào)道所指為非野生型資源[3]，我國(guó)的野生資源僅分布于青藏高原3 000～5 000 m的草甸中且野生資源日益減少。故冬蟲(chóng)夏草有性型研究一直以來(lái)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]且是難點(diǎn)和空白點(diǎn)，雖通過(guò)人工模擬培養(yǎng)可獲得較滿意的僵蟲(chóng)率，但都沒(méi)有進(jìn)入有性階段[5]。隨發(fā)酵技術(shù)的日趨成熟，冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵技術(shù)已成為其資源開(kāi)發(fā)利用的重要途徑[6]，不同冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型作為發(fā)酵原料，為發(fā)酵技術(shù)的評(píng)價(jià)帶來(lái)了困難。研究主要就冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型相關(guān)類群展開(kāi)，以目前綜述較少的中國(guó)被毛孢及其同種異名和同物異名菌種為原料，對(duì)固體、液體發(fā)酵技術(shù)研究現(xiàn)狀展開(kāi)綜述。

1 冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型

蟲(chóng)草菌是蟲(chóng)草屬真菌的統(tǒng)稱[7]，目前，全球記載蟲(chóng)草菌的有500多種[8]，中國(guó)記載的蟲(chóng)草有120種[9]。楊濤等[1]從冬蟲(chóng)夏草分離出冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型菌株且經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)得到了與野生冬蟲(chóng)夏草完相同的子囊孢子，此后在專利NO.85101971（1985）中命名為冬蟲(chóng)夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）；劉錫琎等[10]從四川采集了大量冬蟲(chóng)夏草并分離出相同菌株，首次命名并證實(shí)中國(guó)被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型；印象初等[11]將冬蟲(chóng)夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）重新命名為中華束絲孢（Synnematium sinense）；張顯恥等[12]用冬蟲(chóng)夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)，將該菌定名為蝙蝠蛾多毛孢（Hirsutella hepiali）。顯然，冬蟲(chóng)夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchong xiacae）、中華束絲孢（Synnematium sinense）和蝙蝠蛾多（被）毛孢（Hirsutella hepiali）屬同物異名。此外，研究人員分離獲得其他冬蟲(chóng)夏草新種，如中國(guó)擬青霉（Paecilomyces sinensis）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepialid）、蝙蝠娥擬青霉（Paecilomyces hepialid）等。但是，除中國(guó)被毛孢和中華束絲孢（即冬蟲(chóng)夏草頭孢或蝙蝠蛾多毛孢）以外，其他新種均與冬蟲(chóng)夏草全DNA相似率差別較大[13-17]，而且根據(jù)國(guó)際植物命名法則的條款、原則和優(yōu)先率，只有中國(guó)被毛孢和中華束絲孢為合格名，中國(guó)被毛孢和中華束絲孢屬同種異名[18]，國(guó)際公認(rèn)的冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型為只有中國(guó)被毛孢（Hirsutella sinensis）。目前，雖然冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的種類很多，“一名稱對(duì)應(yīng)一真菌”將成為以后真菌命名的趨勢(shì)[19]，但發(fā)酵原料的不同會(huì)給發(fā)酵條件帶來(lái)很大的影響，以中國(guó)被毛孢或其同種異名或同物異名菌種作為發(fā)酵原料對(duì)發(fā)酵技術(shù)予以綜述。

2 固體發(fā)酵技術(shù)

固體發(fā)酵具有成本低、環(huán)保、過(guò)程易控等特點(diǎn)。固體發(fā)酵研究主要以菌絲體生物量為指標(biāo)，李春如等[20]以菌絲長(zhǎng)勢(shì)為指標(biāo)，確定最佳氮源為奶粉＞黃豆粉＞酵母粉＞麩皮，碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較小，適宜碳源為葡萄糖、蔗糖以及果糖，30%接種量對(duì)菌絲生長(zhǎng)有顯著的影響，CMC和玻璃珠能限制菌絲生長(zhǎng)；張安寧等[21]以生長(zhǎng)面積和生長(zhǎng)情況為標(biāo)準(zhǔn)篩選出最佳氮源為脫脂奶粉、蛋白胨、酵母膏，最佳碳源為蔗糖、葡萄糖；周宇爝等[22]以中國(guó)被毛孢的菌絲體生物量為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)氮源對(duì)菌絲體生物量的影響從大到小依次為：黃粉蟲(chóng)蛹粉、牛肉蛋白胨、黃粉蟲(chóng)粉，蛋白胨、大豆效果最差，故中國(guó)被毛孢優(yōu)先選擇與蝙蝠蛾幼蟲(chóng)相似的動(dòng)物性蛋白。

以功能成分為指標(biāo)的研究相對(duì)較少，葛飛等[23]以中國(guó)被毛孢總核苷類物質(zhì)為指標(biāo)，最佳營(yíng)養(yǎng)需求為酵母浸出粉3%、KH2PO40.2%、奶粉1%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.1%，可顯著提高總核苷類物質(zhì)的含量，此后，葛飛等[24]以中國(guó)被毛孢為原料，以麥角甾醇含量為指標(biāo)篩選出最佳培養(yǎng)基：玉米粉2 g、大米5 g、蠶蛹粉1 g、麩皮2 g，料層厚度2 cm且無(wú)光照、培養(yǎng)溫度為20 ℃、料水比1∶1.5。

綜上所述，冬蟲(chóng)夏草的固體發(fā)酵技術(shù)報(bào)道較少，碳源對(duì)菌絲體生物量的影響較小，碳源用葡萄糖、玉米粉、大米和麩皮，氮源對(duì)菌絲體生物量的影響較大，動(dòng)物性氮源優(yōu)于植物性氮源，而且添加蝙蝠蛾科幼蟲(chóng)相似的動(dòng)物性氮源效果最好，發(fā)酵溫度為20～25 ℃且無(wú)光照、適宜無(wú)機(jī)鹽添加量有利于菌絲體生長(zhǎng)，料水比各有差異，但均趨向于料水比為1∶1.5。雖然冬蟲(chóng)夏草菌固體發(fā)酵技術(shù)取得了好的進(jìn)展，但研究大多以菌絲體生物量為指標(biāo)考察發(fā)酵參數(shù)，以冬蟲(chóng)夏草菌功能成分為指標(biāo)的研究很少，有研究者從廢棄的蛹蟲(chóng)草大米培養(yǎng)基中提取得到蟲(chóng)草素并進(jìn)行了純化工藝的研究[25]，為冬蟲(chóng)夏草固體發(fā)酵產(chǎn)有效成分的開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟了新的途徑，而目前沒(méi)有利用中國(guó)被毛孢侵染蝙蝠蛾科幼蟲(chóng)獲得功能成分的研究，亦希望相關(guān)研究能在這一方面取得突破。

3 液體發(fā)酵技術(shù)

液體發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、發(fā)酵產(chǎn)物易于開(kāi)發(fā)利用、發(fā)酵參數(shù)易于控制、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。而以菌絲體生物量為指標(biāo)的液體發(fā)酵多，功能成分為指標(biāo)的研究很少。

以冬蟲(chóng)夏草頭孢菌為原料的液體發(fā)酵較多。鐘士清等[26]以冬蟲(chóng)夏草頭孢菌改良菌株A10為原料，以菌絲體生物量為指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵條件：葡萄糖4%、酵母粉1%、MgSO4·7H2O 0.05%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%，發(fā)酵溫度為26～28 ℃，pH 5.0～7.0，接種量為5%，菌絲體對(duì)溶氧量要求不高，試驗(yàn)中轉(zhuǎn)速為200 r/min；陳濟(jì)琛等[27]以冬蟲(chóng)夏草頭孢菌為原料，在1%葡萄糖中分別加入2%玉米粉、2%麩皮、20%馬鈴薯，以2%米糠為空白對(duì)照，pH6.0～7.0，含有2%麩皮培養(yǎng)基中菌絲體生物量最大；楊淑全等[28]配制4種液體培養(yǎng)基，以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)，于25 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)9 d后測(cè)菌絲體干質(zhì)量，確定D組比其他組的菌絲體干質(zhì)量顯著增加，D組培養(yǎng)基組分為葡萄糖2.5%、玉米漿0.5%、酵母粉0.5%、蛋白胨0.7%、CaCO30.15%、KH2PO40.15%、pH自然；趙潤(rùn)等[29]以冬蟲(chóng)夏草菌為原料，發(fā)酵溫度為24 ℃，發(fā)酵192 h后測(cè)菌絲體干質(zhì)量，篩選出優(yōu)化培養(yǎng)基為蔗糖1.25%、葡萄糖1.25%、酵母粉0.0625%、蛋白胨0.02%、KH2PO40.025%、MgSO4·7H2O 0.0125%、VB10.0025%、pH自然；吳彩琴等[30]以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)，篩選出最佳發(fā)酵條件為溫度26 ℃、接種量5%、發(fā)酵時(shí)間為4 d、溶氧條件為1 L/min。

以中國(guó)被毛孢為原料的液體發(fā)酵研究較少。王祖華等[31]以青海采集的冬蟲(chóng)夏草菌索提取得到的冬蟲(chóng)夏草菌為原料，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為中國(guó)被毛孢，在20 ℃發(fā)酵192 h測(cè)干質(zhì)量，篩選出最佳發(fā)酵條件為蔗糖7.5%、葡萄糖7.5%、酵母粉0.375%、蛋白胨0.12%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.075%、VB10.015%、pH自然；劉欣等[32]從青海野生冬蟲(chóng)夏草中分離得到冬蟲(chóng)夏草菌，經(jīng)中科院微生物所鑒定為中國(guó)被毛孢，以菌絲體干質(zhì)量為指標(biāo)，在18 ℃、120 r/min、pH6.8條件下，篩選出最佳培養(yǎng)基組分：葡萄糖2.71%、牛肉水60%、蛋白胨20%、KH2PO40.23%，氮源和碳源均對(duì)菌絲體生物量有正效應(yīng)，氮源含量＞60%，KH2PO4對(duì)菌絲體生物量為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)適當(dāng)添加，效應(yīng)大小依次為：牛肉水＞蛋白胨＞葡萄糖；DONG C H等[33-34]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有蔗糖、維生素B、鋅、鈣及碳氮比12∶1條件下最有利于菌絲體生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度為15～18 ℃，超過(guò)25 ℃便停止生長(zhǎng)。

綜上所述，氮源和碳源對(duì)菌絲體生物量都有正效應(yīng)，氮源的影響大于碳源的影響，適宜碳源為葡萄糖和其他碳源的復(fù)合碳源，氮源為酵母粉和蛋白胨復(fù)合氮源，鋅、鈣、VB1能促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)，KH2PO4對(duì)菌絲體生物量有負(fù)效應(yīng)，應(yīng)適宜添加，液體發(fā)酵溫度為20～28 ℃，僅少數(shù)研究報(bào)道15～18 ℃且＞25 ℃停止生長(zhǎng)、＞30 ℃菌株死亡，轉(zhuǎn)速為120～150 r/min，發(fā)酵pH值為5.0～7.0。提高蟲(chóng)草素含量的方法較多，除了改善發(fā)酵條件外，添加蟲(chóng)草素合成的前體物及其協(xié)同氨基酸[35-36]、激發(fā)子等可顯著提高蟲(chóng)草素產(chǎn)率[37]。而在有性型人工培育方面，蛹蟲(chóng)草全世界分布廣泛且可人工大范圍栽培，冬蟲(chóng)夏草人工栽培尚未成功，兩者功能成分的差異決定人工栽培的成功與否是需要明確的關(guān)鍵問(wèn)題之一。曲鴻雁等[38]利用冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草融合子進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)，從該研究可拓展冬蟲(chóng)夏草有性型人工培育的新思路，是否可利用中國(guó)被毛孢和滅活的蛹蟲(chóng)草菌復(fù)合體以補(bǔ)充中國(guó)被毛孢功能成分，進(jìn)行冬蟲(chóng)夏草有性型人工培養(yǎng)測(cè)試。

4 展望

（1）冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵技術(shù)的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系尚不成熟，以菌絲體干質(zhì)量或發(fā)酵產(chǎn)物中單一有效成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，無(wú)法全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)發(fā)酵技術(shù)，而且以不同菌株為發(fā)酵原料，篩選出的最佳發(fā)酵條件會(huì)有很大差異，因此，冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵技術(shù)的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系有待進(jìn)一步完善。

（2）在有效成分開(kāi)發(fā)利用方面，液體發(fā)酵有著諸多優(yōu)勢(shì)，對(duì)核苷類、甾醇、蛋白類等有效成分的開(kāi)發(fā)利用有很大的幫助，冬蟲(chóng)夏草菌液體發(fā)酵產(chǎn)有效成分的研究成為其資源開(kāi)發(fā)利用的趨勢(shì)，而蛹蟲(chóng)草菌有望取代冬蟲(chóng)夏草菌，成為更可靠、高效的產(chǎn)有效成分的液體發(fā)酵原料。

（3）雖然發(fā)酵技術(shù)作為冬蟲(chóng)夏草資源開(kāi)發(fā)利用的有效途徑，但期望有關(guān)研究能取得重大突破，人工培育出冬蟲(chóng)夏草有性型。

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