活性氧在多能干細胞中的作用*

徐 潔， 劉俊許， 康雪玲， 蔣 麗， 周忠偉， 陳思鋒， 孟 丹

多能干細胞是具有自我更新能力和能向體內多種細胞分化的一類細胞群體。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是反應活性極強的代謝分子。雖然過多的ROS會對干細胞產生毒性，引起干細胞的衰老和凋亡，但是ROS的調節在維持干細胞的干性和分化中起重要作用。ROS在不同的干細胞中發揮的作用也不盡相同。深入了解ROS如何調控干細胞的功能將有助于加強干細胞在轉化醫學方面的應用。本文將以胚胎干細胞和誘導性多能干細胞為主，對近年來ROS調節多能干細胞功能的研究進行簡要綜述。

1 多能干細胞

干細胞是具有自我更新能力和能向體內多種細胞分化的一類細胞群體。根據干細胞增殖能力和分化潛能的不同，可以把干細胞分為具有無限增殖、分化潛能的多能干細胞 (pluripotent stem cells)和增殖、分化能力有限的成體干細胞(adult stem cells)。多能干細胞主要包括胚胎干細胞 (embryonic stem cells，ESCs)和誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)等。這些細胞具有在體外特定的培養條件下無限增殖和分化為機體內任何種類細胞的潛能。因此，多能干細胞在再生醫學領域有巨大的應用潛力和優勢［1］。ESCs是動物早期發育囊胚期內細胞團細胞在體外特定培養條件下獲得的永生細胞［2］。iPSCs最初是 2006 年由 Takahashi等［3］研究小組把4種與維持胚胎干細胞全能性相關的基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)通過逆轉錄病毒載體轉入小鼠的成纖維細胞，使其重編程而獲得。隨后，人的iPSCs也從多種體細胞獲得［4］。iPSCs表現出許多與ESCs相同的特點:包括形態，基因表達標志物以及在體內的全能性［5］。iPSCs可用于建立疾病細胞模型，研究疾病的發生機制和進行藥物篩選［6］。目前，干細胞治療已經用于臨床治療相關疾病，因此iPSCs在干細胞治療方面有著非常廣闊的應用前景。

2 活性氧

ROS是反應活性極強的代謝分子，主要包括超氧陰離子(O－·2)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)。生理情況下，細胞內ROS的產生主要來源于線粒體。線粒體氧化磷酸化過程中產生較低水平的超氧陰離子，隨后其很快被超氧化物歧化酶轉化成過氧化氫。過氧化氫相對于超氧陰離子而言比較穩定，可被谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶水解。此外過氧化氫也可通過Fenton反應轉化成化學性質更活潑的羥自由基。過多的ROS會對細胞產生毒性，引起細胞的衰老和凋亡，許多疾病如動脈粥樣硬化、心衰、高血壓、糖尿病、帕金森病和衰老等，都與ROS產生過多有關［7-8］。但是低水平的ROS可作為許多刺激因子的第2信使，參與調節細胞的遷移、增殖、黏附、分化等多種生理功能。NADPH氧化酶是干細胞產生ROS的主要來源之一。NADPH氧化酶主要由跨膜結構(Nox和p22phox)和胞漿成分(p47phox、p67phox、p40phox及 Rac1)組成［9］。近年來研究發現，NADPH氧化酶來源的ROS參與調控干細胞(或祖細胞)的多種功能，包括干細胞的增殖、遷移、干性維持、分化以及基因表達［7-8，10-15］。因此，深入了解ROS如何調控干細胞的功能將有助于加強干細胞在轉化醫學方面的應用。

3 ROS在多能干細胞中的作用

近年來，科學家們對ROS在多能干細胞中的作用進行了廣泛的研究。盡管ROS在不同的干細胞中發揮的作用不盡相同，但是科學家們基本得出一個共識:ROS水平的變化參與調控干細胞的功能和命運。干細胞氧化還原調節的改變在疾病的發病機制中起重要作用。

3.1 ROS對ESCs和iPSCs黏附、增殖、衰老和凋亡的影響 生理情況下，低水平的ROS在維持多能干細胞的正常功能中起重要作用。但是過高水平的ROS可造成多能干細胞的損傷和自我更新、黏附、增殖、遷移等功能失常，加速細胞衰老與凋亡［5，7，16-22］。例如:血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)能夠保護細胞免受氧化應激導致的細胞損傷，而HO-1基因缺陷型的iPSCs內ROS水平增高，對氧化應激引起的細胞凋亡更敏感［5］。我們最近的研究發現，H2O2通過減少黏附相關基因如integrin alpha 7、cadherin 1、cadherin 5和VCAM-1等基因的表達，抑制iPSCs的黏附，黏附的功能缺失影響了iPSCs遷移的能力;同時H2O2的暴露抑制了iPSCs的增殖功能，誘導細胞的衰老和凋亡［14］。以往的研究也證實，H2O2抑制ESCs的黏附和細胞周期蛋白cyclin D1的表達，引起細胞周期阻滯并誘導凋亡［23］。ROS影響細胞黏附的機制可能與抑制整合素依賴的細胞信號轉導途徑有關［14，24］。

同時，很多研究證實:減少或抑制干細胞內ROS的產生，能阻斷ROS誘導的多能干細胞功能的失常。白藜蘆醇能夠顯著增加小鼠iPSCs內錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的表達和細胞內谷胱甘肽的水平，因此減少氧化應激導致的 iPSCs損傷［22］。飛燕草素(delphinidin)，一種具有抗氧化特性的植物色素，可以通過減少小鼠ESCs內 ROS介導的JNK和NF-κB的激活，抑制低氧誘導的 ESCs凋亡［25］。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，一種自由基清除劑，也能通過抑制ROS產生，抑制在iPSCs向血細胞分化過程中細胞的衰老和凋亡［20］。

3.2 ESCs和 iPSCs自身的抗氧化性 針對過量ROS對干細胞生理和功能的毒害現象，一些研究表明:多能干細胞相對于成體細胞而言，具有更強的抗氧化能力。人ESCs和iPSCs主要是通過增加ROS的清除能力和減少ROS產生來維持干細胞基因組的完整性［7，16］。在人的 iPSCs產生過程中，線粒體基因組的拷貝數明顯減少，從而使得ROS產生減少，并且iPSCs的抗氧化基因表達增高，這與ESCs的情況極為相似［16］。研究證實:ESCs通過增加端粒酶活性、增強自身的DNA修復能力以及抗氧化能力，從而維持干細胞的干性［26］。最近的一項研究也證實，小鼠的ESCs對于短暫的H2O2誘導的衰老是有抗性的［23］。

然而，我們新近的研究發現iPSCs對氧化應激引起的細胞毒性較敏感，H2O2濃度大于25 mmol/L時就可以引起小鼠iPSCs阻滯在G2/M期，并誘導細胞的衰老和凋亡;而相比之下成體成纖維細胞在H2O2大于150 μmol/L才明顯加速衰老、凋亡，至H2O2濃度為400 μmol/L 時出現快速的死亡［14］。Guo 等［23］也報道與成纖維細胞和血管平滑肌細胞比較，ESCs對H2O2引起的細胞毒性更敏感。另有研究證實，短暫的非毒性劑量的H2O2暴露就可以引起干細胞胰島素抵抗信號通路的轉化，以及糖尿病和腫瘤發生途經的誘導激活［27］。可見，不同類型的細胞對H2O2引起的氧化應激有不同的反應和耐受。這些研究結果的不一致可能與細胞密度和種類、H2O2干預的濃度和時間等實驗條件的不同有關。另一方面，盡管通常干細胞比成體細胞有更強的抗氧化性，但在創傷應激或ROS調節基因缺陷的情況下，ROS耐受閾值較低的iPSCs和ESCs可能更傾向于積累超過其耐受量的ROS，從而對ROS的細胞毒性更加敏感。當氧化應激超過了多能干細胞耐受的能力時，干細胞通過衰老或凋亡途徑清除損傷的細胞以保證基因組的完整性。

3.3 ROS對 ESCs和 iPSCs分化的影響 ROS在ESCs和iPSCs的分化中也起著重要的作用。低水平的ROS是維持人和小鼠干細胞自我更新所必須的，增高的ROS水平則會促進干細胞的分化［7，28］。在多能干細胞向不同種類細胞分化的過程中，ROS所起的作用也有所不同，甚至截然相反。一些研究表明，ROS 促進 ESCs和 iPSCs 的分化［5，29-30］。在對ESCs向心肌細胞分化的研究中發現，高糖環境(25 mmol/L)通過增加Nox4表達促進ROS生成，進而激活p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)，促進 ESCs向心肌細胞分化;而在生理水平糖濃度(5 μmol/L)的培養基中，ESCs無法被誘導分化成心肌細胞［30］。其中，Nox4是NADPH氧化酶的一個重要亞基，Nox4蛋白表達的增加可直接激活NADPH氧化酶，促進細胞ROS產生。Nox4產生的ROS在ESCs向血管平滑肌細胞分化的過程中也起重要作用。轉化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可激活 Nox4，促進Nox4轉移到ESCs核內產生ROS，進而促進血清反應因子(serum response factor，SRF)與心肌蛋白(myocardin)形成復合體，促進血管平滑肌細胞的分化［29］。此外，在 HO-1 基因缺陷型的 iPSCs，由于ROS水平的增高，其比正常的iPSCs更易失去多能性，更易發生自發性分化［5］。類似地，ROS也促進iPSCs分化成神經細胞，其與ROS激活ERK1/2信號通路有關［15］。

但在另一些情況下，ROS會阻礙ESCs和iPSCs的分化，ESCs和iPSCs分化成骨細胞和造血細胞的過程揭示了ROS在干細胞分化中的阻礙作用。白藜蘆醇通過降低ROS的水平能夠在1～2周內顯著上調鼠iPSCs類成骨分化時的成骨標志物Runx2、osteopontin等，顯示了多余的ROS可能阻礙 iPSCs分化成骨細胞［22］。在另一個研究中，iPSCs用NAC處理后，CD34、CD43、CD45等血細胞標志物陽性的細胞數量大大上升，提示抑制ROS水平能夠促進iPSCs向造血細胞的分化，揭示了ROS本身對iPSCs血細胞細胞分化的抑制作用［20］。

目前，在ROS的調控下，ESCs和iPSC可誘導分化成心肌細胞、血管細胞、神經樣細胞、脂肪細胞、造血細胞和骨樣細胞等等［22］。ROS水平的變動在某些情況為多能干細胞的分化提供了條件，而在另外一些情況下卻促進了去分化，這些具體的調控機制仍有待進一步研究。

4 ROS相關的干細胞疾病模型

ROS相關的基因缺陷的ESCs可以導致疾病的發生。而對于iPSCs來說，從病人身上提取的細胞可以被誘導成iPSCs，從而提供較好的研究疾病發生機制和藥物篩選的模型。這里我們介紹一些利用iPSCs建造的疾病模型。

ROS相關基因缺陷的先天疾病的iPSCs模型能夠給疾病的發病機制和治療帶來新的思考。如:科凱恩綜合征(Cockayne syndrome，CS)是一種以提早老化和DNA修復功能缺陷為特點的人類基因疾病。為了更深入地了解該疾病的發病機制，科學家們用病人的成纖維細胞制成了iPSCs。來源于CS的iPSCs表現出了高于正常情況的細胞死亡率、高水平的ROS產生、硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的上調和p53在轉錄水平的上調［18］。另一個先天疾病的例子是X染色體連鎖的慢性肉芽腫性疾病(X-linked chronic granulomatous disease，CGD)，這類病人的中性粒細胞是NADPH氧化酶缺陷型的，因此這些細胞不能有效消化被胞吞和胞飲的內容物，逐漸形成了肉芽腫［31-33］，目前造血干細胞移植術是針對該病的唯一一種有效治療手段［33］。通過將病人的成纖維細胞重編程成 iPSCs，可以建立CGD的疾病模型。研究表明，由這些iPSCs分化而成的巨噬細胞內盡管缺乏ROS，它們具有正常的吞噬能力，提示了巨噬細胞內可能存在相關補償機制，這些發現為該病的治療提供了一些新的思路［31］。另一方面，某些iPSCs疾病模型提供了一些證明發病可能與ROS調控相關的證據。例如在帕金森綜合癥中，從該病病人身上分離的細胞誘導成的iPSCs，其抵抗氧化應激的能力是下降的。此外，暴露于ROS中的ESCs和iPSCs傾向于獲得胰島素抗性，這可能會成為糖尿病的模型［7］。除了建立和研究疾病模型，運用到iPSCs的治療方法方興未艾，目前在鐮狀紅細胞貧血癥、血友病A、肝病、帕金森氏病、急性心肌梗死、糖尿病等疾病的治療中都有成功的案例［34］。如白藜蘆醇在iPSCs骨向分化中的作用為骨整形手術的干細胞治療法提供了思路［22］。通過有效地調節ROS，由H9c2細胞重編程獲得的iPSCs能夠抑制細胞凋亡、被誘導分化成心肌細胞，并且在心肌梗死的心臟經歷iPSCs手術后顯著增多了血管平滑肌細胞和內皮細胞［35］。一個最近的研究邁出了令人振奮的一步——iPSCs能夠被誘導分化成心血管主要細胞成員中的每一種細胞，包括平滑肌細胞、內皮細胞、血管壁細胞和心肌細胞等，使iPSCs在心血管再生醫學方面具有更廣闊的應用前景［21，35］。

5 結語

本文回顧了近年來ROS在ESCs和iPSCs中的作用，調控機制以及與ROS相關的疾病模型。這些研究提示ROS的調節在維持干細胞的干性、增殖、凋亡和分化中起重要作用。根據目前研究我們認為，ROS相關的基因缺陷的iPSCs或ESCs可能比成體細胞的抗氧化性更低。ROS在這2種細胞分化中的水平變化可能取決于它們的分化方向，同時因為細胞分化是一個動態連續的過程，ROS的水平在分化過程中可能是一個動態的變化過程。由于干細胞類型，ROS檢測時間和方法，以及實驗條件的差異，可能導致研究結果的不同。目前仍然有一些問題有待于解決:ESCs和iPSCs是否比普通成體細胞更耐受氧化應激反應?是否存在這樣一個ROS水平的范圍，低于或高于這個范圍都對干細胞有害?在分化過程中ROS如何影響干細胞向不同的細胞分化?如何調控ROS使其輔助iPSCs定向分化為治療所需的特定細胞?因此利用ROS調控干細胞的功能將有助于加強干細胞在轉化醫學方面的應用。

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