電針對高血壓大鼠腦梗死頸髓Rho-A表達的影響*

譚 峰 陳 杰 梁艷桂 李雁萍 王學文 蒙 迪 程南方 徐麗紅

（廣州中醫藥大學附屬醫院佛山中醫院，廣東 佛山 528000）

電針是促進急性腦梗死（ACI）神經功能恢復的有效方法，但其機制尚未完全闡明。筆者在前期研究中發現電針對大鼠腦缺血區皮層損傷的保護作用，與其下調中樞神經軸突再生抑制因子neurocan-mRNA和Nogo-A表達等機制密切相關［1-2］。本研究在前期基礎上，復制易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）一側大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，觀察電針對腦缺血再灌注（I/R）第 1、7、14、28 日不同時間點腦梗死頸髓Rho-A表達的影響，探討電針對腦梗死遠隔損害影響的可能機理。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 封閉群純種SPF級SD雄性大鼠480 只，體質量（70±20）g，鼠齡 30 d 左右［合格證號：scxk（粵）2008-0020］，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。統一用顆粒型普通大鼠飼料喂養，飲用涼開水，自由攝食條件下適應性喂養7 d。行雙腎雙夾術復制RHRSP，采取尾動脈測壓術篩選造模成功大鼠370只，采用隨機數字表分為高血壓組60只、假手術組60只、擬造MCAO模型組250只，采用Longa的5分制法，在動物麻醉清醒后進行神經功能缺損評分，分值在1~3分的大鼠納入，共有190只MCAO造模成功，從中隨機抽取10只大鼠行TTC染色確定梗死范圍，將剩余的180只MCAO大鼠隨機分為模型組60只、電針組60只、假電針組60只。

1.2 雙腎雙夾術復制RHRSP模型 體質量70～90 g的雄性SD大鼠480只，按雙腎雙夾法復制成RHRSP模型［3-4］。使用SDP-1型大型大鼠血壓計進行血壓監測，術前測量1次作為基礎血壓，術后第1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周各監測血壓1次。測量前使用風筒給大鼠尾巴預熱5 min，然后將大鼠歸于籠中，尾巴置入測壓橡膠圈，待大鼠安靜后測量清醒狀態下大鼠尾動脈的收縮壓，重復測量3次，取其平均值作為大鼠的血壓值。術后12周，將收縮壓高于180 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），且無自發卒中征象的大鼠行MCAO術。

1.3 MCAO術復制腦梗死模型 制作MCAO模型的RHRSP：（1）雙側腎動脈狹窄術后12周；（2）血壓≥180 mmHg；（3）未出現卒中的癥狀和體征。MCAO模型的復制：參照Zea Longa方法加以改進［5-6］。神經功能缺失體征評分參考Longa的5分制法在動物麻醉清醒后進行評分。評分1~3分者納入研究。

1.4 分組與處理 （1）高血壓組：只復制 RHRSP模型，不予任何治療。（2）假手術組：RHRSP行頸部正中切口，僅作分離肌肉、筋膜與頸動脈處理。（3）腦梗死組：RHRSP基礎上的制作MCAO模型。（4）電針組：MCAO模型按文獻方法定位大鼠百會、大椎穴位。刺法：用30號1寸毫針，沿皮斜刺大椎、百會兩穴，進針深度2～3 mm。針柄接至G68051 A型電針儀電極上，強度為3 V，頻率為3 Hz連續波，以肌肉輕微抽動、動物不掙扎嘶叫為度，時間持續15 min［7-8］。電針組于造模當天動物清醒后開始治療，每日1次，共28 d。（5）假電針組：僅將針灸針貼于MCAO模型大鼠相應穴位的皮膚上。

1.5 檢測指標及方法 （1）大鼠神經功能評分。①評分時間點：MCAO術后動物清醒時、MCAO術后第1、7、14、28日。②評分標準：參考Longa的5分制法進行評分。（2）尼氏染色檢測神經元數目。①脊髓組織取材。各組大鼠在MCAO術后第1、7、14和28日作神經功能評分后，隨機抽取每個時間點大鼠6只，用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后（0.4 mL/kg），快速開胸，經左心室向主動脈插管，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水約200 mL，待右心房流出清亮液體后再換用10%福爾馬林灌注固定腦組織，約300 mL后斷頭取脊髓，將脊髓標本置于10%福爾馬林中固定24 h，移入Leica自動脫水機脫水。取延髓錐體交叉上右側和左側脊髓組織，常規石蠟包埋，進行冠狀連續切片，片厚4 μm，硅烷化防脫玻片撈片，60℃烤片30 min，4℃保存備用。②尼氏染色。選取每只大鼠的石蠟切片，每隔10片取1片，尼氏染色檢測大鼠神經元數目，用BX51系統生物顯微鏡和AZ100型體視光學顯微鏡下觀察、計數與拍照。

1.6 Western blot檢測Rho-A表達 各組大鼠在MCAO術后第1、7、14和28日，隨機抽取每個時間點大鼠6只，用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后（0.4 mL/kg），快速斷頭開顱取脊髓，然后迅速分離出右側延髓和左側脊髓，用生理鹽水洗滌后立即放入1.5 mL離心管中，-80℃保存。以β-Actin（43kD）蛋白條帶為參照，分別分析各組大鼠各蛋白分子量相對于β-Actin各蛋白條帶的相對密度。全部圖像采用計算機輔助軟件分析系統（ImageJ）專業圖像處理軟件進行分析。

1.7 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組頸髓神經元數目比較 見表1。MCAO術后第 1、7、14 日，各組間頸髓神經元數目相近（P>0.05）。第28日，與高血壓組比較，假手術組脊髓神經元數目相近（P＞0.05）；與腦梗死組比較，電針組脊髓神經元數目減少明顯（P＜0.05），假針刺組脊髓神經元數目減少不明顯（P＞0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點頸髓神經元數目（個

表1 各組大鼠不同時間點頸髓神經元數目（個

與高血壓組同時間比較，△P＜0.05；與腦梗死組同時間比較，*P＜0.05。下同。

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2.2 各組頸髓Rho-A表達比較 見表2，圖1。與高血壓組比較，MCAO術后第1、7、14日，假手術組、腦梗死組、電針組、假電針組Rho-A的表達與其相當（P＞0.05）；第28日，腦梗死組、電針組、假電針組Rho-A的表達升高 （P＜0.05）。 與腦梗死組比較， 第1、7、14日，電針組和假電針組Rho-A的表達與其相當 （P＞0.05）；第 28 日，電針組 Rho-A 的表達降低（P＜0.05），假電針組Rho-A的表達與其相當（P＞0.05）。

表2 各組大鼠不同時間點脊髓Rho-A的表達

表2 各組大鼠不同時間點脊髓Rho-A的表達

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圖1 大鼠不同時間點頸髓Rho-A含量

3 討 論

越來越多的證據表明，局灶性腦梗死可導致遠隔部位CNS神經組織繼發性損害，并阻礙神經功能的恢復。ACI遠隔部位中樞神經軸突丟失、變性、回縮、塌陷等都不同程度地與CNS神經生長抑制因子密切相關。Rho-A是CNS軸突抑制重要的信號傳導物質，在抑制成熟CNS神經元軸突再生中發揮重要作用。CNS軸突再生抑制因子NogoA等通過與其受體NgR等結合，經Rho-A介導將抑制信號從胞外跨膜傳遞至胞內，啟動胞內Rho/ROCK信號通路，激活下游的Rho激酶，直接引起肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，形成MLCP（myosinlig ht chain phosphatase），使肌球蛋白整體磷酸化下降，導致神經生長錐胞體回縮，最終崩潰，從而使軸突再生、細胞擴增受到抑制，阻礙神經修復。在RhoA V14-轉染的神經元細胞中，多數細胞只有光禿禿的樹突主干，樹突棘的密度明顯降低甚至是缺如，樹突棘的長度明顯縮短。而在使用Rho蛋白激酶的特異性抑制劑Y-27632后，神經元異常的形態學變化有所逆轉，表明Rho-A信號轉導通路在神經元樹突分支方面發揮重要作用［9］。體內外研究證實，Y-27632等RoCK的抑制因子，可以使Rho-A激酶特異性失活，從而促進神經軸突再生；大鼠脊髓損傷后鞘內注射Y-27632，可以觀察到背側脊髓軸突生長，且大鼠后肢功能可以得到明顯改善［10-11］。體外研究證實阻斷Rho-A/ROCK的活性能夠抑制Nogo-A對軸突生長的抑制作用，促進軸突再生［12］。Rho-A/ROCK通路抑制劑還能夠減少神經元丟失，減輕神經組織損傷程度，促進軸突再生和功能恢復［13］。本實驗提示局灶性腦梗死后，遠離梗死灶的頸髓發生了繼發損害，Rho-A抑制因子表達的增高是ACI遠隔損害的一個重要原因，且漸進性繼發遠隔損害的持續時間較長。此為腦梗死遠隔損害發生的時間窗研究提供了一定的參考資料。

電針是促進ACI神經功能恢復的有效方法。針刺百會穴可顯著提高腦中風患者ADL量表評分，增強腦缺血大鼠 NGF 表達，阻止 Ca2+超載［14］，電針大椎、百會穴能顯著促進大鼠腦梗死肢體神經功能恢復，減少缺血缺氧新生大鼠病灶側海馬神經元內尼氏體脫失現象，減輕SD大鼠局灶性腦缺血再灌注大腦皮層超微結構形態學損傷［15］。盡管電針治療ACI的研究已取得長足進展，但在CNS抑制信號傳導通路領域的報道甚少。前期實驗表明，電針對大鼠腦缺血區皮層損傷的保護作用，與其下調中樞神經軸突再生抑制因子neurocanmRNA 與 Nogo-A 表達等機制密切相關［3-4，16］。 但電針對Rho-A有何作用尚不清楚，電針對梗死灶遠隔損害部位Rho-A的影響如何，目前國內外尚未見翔實的報道。本研究中，筆者選取與腦皮層有密切纖維聯系的遠隔損害部位頸髓，通過觀察電針對Rho-A抑制信號表達的影響，探討腦梗死遠隔損害的發生機理以及電針的干預作用。結果顯示，電針組頸髓神經元數目明顯高于腦較梗死組，MCAO術后第28日，電針組頸髓Rho-A表達較腦梗死組明顯降低，提示電針對高血壓大鼠腦缺血損傷的保護作用還與減輕ACI遠隔部位繼發性損害有關，電針促進神經功能修復的作用可能與阻遏中樞神經抑制信號Rho-A蛋白表達等機制密切相關。此為電針減輕ACI遠隔損害的機理研究和臨床應用賦予了新內涵。

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