壯醫針挑療法對哮喘模型小鼠TSLP mRNA及 IL-4、IL-5、IL-13 的影響*

唐漢慶 竇錫彬 李克明 李曉華 朱曉瑩 鄭建宇

（右江民族醫學院，廣西 百色 533000）

研究認為T細胞的激活及其釋放的細胞因子是哮喘炎癥過程的關鍵環節［1］。在炎癥過程中，Th2細胞起著重要的介導作用，其釋放的白介素（IL）-4、IL-5、IL-13等細胞因子與哮喘的炎癥反應密切相關，胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP)對Th2細胞優勢分化有調控作用。本實驗建立哮喘小鼠模型，觀察壯醫針挑療法對哮喘模型小鼠 TSLP mRNA及IL-4、IL-5、IL-13的影響，討論其可能的止咳平喘機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠40只，6～8周齡，體質量（26.13±3.14）g，由右江民族醫學院科學實驗中心購買并提供，合格證編號SCXK（京)2013-0001。小鼠按隨機數字表法分4組，即對照組、模型組、針挑組、假針挑組，每組10只。

1.2 試劑和儀器

烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，批號20080610）；卵清蛋白（OVA）（Sigma，USA，批號 s4881）；氯仿（北京化學試劑公司，批號20110322）；異丙醇（北京化學試劑公司， 批號 20100811）；IL-4、IL-5、IL-13 ELISA 試劑盒（R&B 公司，U.S.A）；Trizol（Gibcobrl公司)；M-MLV（Piomegan 公司)；Tag 酶、DNAmark （北京博奧公司)；TSLP基因引物 （Invitrogen公司）。電子天平（AE160型，瑞士Mettler公司）；電動玻璃勻漿機（DY-89型，寧波新芝公司）；超聲波細胞破碎機（SONICS型，U.S.A）；高速低溫離心機（PK121R型，ALC公司)；超低溫冰箱（MDF-U72V型，日本三洋公司）；酶標儀 （MK3型，Thermo Labsystem公司）；凝膠成像系統（chemidoc XRS型，美國伯樂)；PCR 儀（7900HT 型，ABI公司）；紫外分光光度儀（DU530型，Beckman公司）；大號縫衣針（長約 5 cm）；消毒陶瓷片（6 cm×2.5 cm）。

1.3 哮喘小鼠模型制備

參考Perrier等［2］造模方法，加以改良。模型組、針挑組、假針挑組于第1日、4日、7日、10日、13日每日1次，每次1 mL（50 μg/L)分別腹腔內注射OVA混懸液進行基礎致敏，第14日將小鼠置于有機玻璃盒中，給予霧化吸入OVA（0.1 mol/LPBS稀釋OVA 1 mg），每日30 min，連續1周激發。

1.4 干預方法

針挑組在激發階段，激發后1 h以消毒大號縫衣針在小鼠頸1、2棘突或胸1、2棘突下及旁開約4 mm（雙側）取穴位，每次取穴位3～4個作為挑刺點，將針尖快速刺入穴位表皮并挑起，挑出皮內少許纖維組織，然后以消毒陶瓷片割裂表皮，以皮膚不出血為宜，之后用針在該針孔垂直快速點刺，刺入皮下1 mm，出針后以酒精涂抹針口。每日1次，7 d為1個療程。假針挑組用針及陶瓷片按壓挑刺點但不挑刺；模型組和對照組不作特殊處理。治療1個療程。

1.5 檢測項目

1.5.1 肺組織 TSLP mRNA表達水平檢測療程結束后第1日，按5 mL/kg以20%烏拉坦溶液麻醉并固定。眼球取血1.0 mL，3000 r/min離心10 min后收集血清于-70℃保存。用靜脈穿刺針插入氣管內，結扎左主支氣管，將1.0 mL 0.9%氯化鈉注射液經留置針氣道內注入，來回抽吸支氣管肺泡灌洗液，重復3次。取灌洗后的右肺濾紙吸干，-70℃保存，用于檢測肺組織TSLP mRNA表達水平。取100 μL肺組織勻漿，用Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，取10μL根據逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，-70℃凍存備用。取5 μL逆轉錄產物進行PCR擴增反應，并以βactin為內對照。TSLP基因引物由Invitrogen公司設計合成。PCR反應條件：95℃預變性3 min→95℃變性35 s→62℃退火45 s→70℃延伸45 s。共35個循環，最后70℃延伸10 min。具體序列及擴增長度見表1。

表1 引物序列及擴增長度

PCR擴增反應產物經2%瓊脂糖電泳，溴化乙啶染色，通過凝膠電泳分析系統讀取目的基因灰度值，將目的基因灰度值與β-actin基因灰度值的比值作為目的基因mRNA的表達量，目的基因mRNA的表達量=目的基因灰度值/β-actin基因灰度值。

1.5.2 IL-4、IL-5和IL-13檢測 ELISA法檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統計學處理

2 結 果

各組 TSLP mRNA相對表達量及 IL-4、IL-5、IL-13水平比較見表2。與對照組比較，模型組的TSLP mRNA相對表達量及IL-4水平均顯著升高（P＜0.01）；模型組的IL-5、IL-13水平升高 （P＜0.05）。 和模型組比較，針挑組的IL-4水平顯著降低（P＜0.01）；針挑組的TSLP mRNA相對表達量、IL-5及IL-13水平均降低（P＜0.05）。

表2 各組TSLP mRNA相對表達量及IL-4、IL-5、IL-13 水平比較（pg/mL

表2 各組TSLP mRNA相對表達量及IL-4、IL-5、IL-13 水平比較（pg/mL

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3 討 論

哮喘的呼吸道炎癥是以Th2細胞活化、嗜酸性粒細胞浸潤、氣道高反應性（AHR）和血清IgE升高為特征的［3］，Th2細胞活化可釋放細胞因子 IL-4、IL-5、IL-13等，通過生物學效應使小氣道發生炎癥、水腫、痙攣、黏液分泌增多、氣管纖維化，使小氣道狹窄和變形，氣體交換功能發生異常，表現為哮喘患者肺功能不同程度的障礙。

TSLP在不同的組織中著重表達于上皮細胞，在抗原呈體細胞觸發Th2在外周變態反應性疾病中起著關鍵作用［4］，TSLP通過樹突狀細胞引起Th2優勢分化，Th2細胞分化后釋放細胞因子IL-4、IL-5、IL-13引起肥大細胞、嗜酸性粒細胞浸潤及系列變態炎性反應，使氣道發生病理改變導致哮喘發作。TSLP的表達可以調控Th2細胞分化進而影響哮喘的發作，TSLP主要是通過上調Th2細胞的表達使得Th2與Th1的平衡機制向Th2方向傾斜而誘發哮喘等過敏性炎癥，同時可檢測出 IL-4、IL-5、IL-13 等細胞因子水平的升高［5］，從本實驗結果和上述報道結果一致，但TSLP和IL-4、IL-5、IL-13水平是否存在正相關，需進一步的實驗觀察。

針挑療法作為壯醫的特色治療技法，是在壯醫學理論指導下應用的，壯醫專家黃漢儒認為針挑療法的作用機理是挑刺可以激發人體正氣，將郁滯體內的有形或無形之毒從體表針挑點刺點驅出，疏通 “龍路”、“火路”，使“水道”、“氣道”、“谷道”暢通，天地人三氣同步［6］；林辰教授認為壯醫針刺療法在臨床應用較廣，對哮喘、頭痛、失眠等一些慢性病、疑難癥有良好的療效［7］。本實驗觀察到，和模型組比較，針挑組的IL-4水平顯著降低；針挑組的TSLP mRNA相對表達量、IL-5及IL-13水平均降低，說明針挑療法可以降低TSLP mRNA表達、IL-4、IL-5、IL-13水平，推測這可能是其起效的機制之一。TSLP對Th2細胞優勢分化及相關細胞因子的調控作用對于哮喘的治療具有指導意義，使靶向TSLP治療哮喘成為新思維。

［1］ Lees Y，Kim SJ，Kwon SS，et al.Distribution and cytokine production of CD4and CD8T-lymphocyte subsets in patients with acute asthma attacks［J］.Ann Allery Asthma Immuno，2001，86（6)：659-661.

［2］ Perrier C，Thierry AC，Mercenier A，et al.Allergen-specific antibody and cytokine responses，mast cell reactivity and intestinal permeability upon oral challenge of sensitized and tolerized mice［J］.Clin Exp Allergy，2010，40（1)：153-162.

［3］ Rautajoki KJ，Kylaniemi MK，Raghav SK，et al.An insight into molecular mechanisms of human T helper cell differentiation ［J］.Ann Med，2008，40（5)：322-335.

［4］ Zhou B，Comeau MR，De Smedt T，et al.Thymic stromal lymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice［J］.Nat Immunol，2005，6（10)： 1047-1053.

［5］ AL-Shami A，Spolski R，Kelly J，et al.A role for TSLP in the development of inflammation in an asthma medel［J］.J Exp Med，2005，202（6）：829-839.

［6］ 黃漢儒.壯醫理論體系概述［J］.中國中醫基礎醫學雜志，1996，2（6)：3-7.

［7］ 林辰，蔣桂江，陳攀，等.壯醫針刺研究的新進展［J］.中國民族醫藥雜志，2011，17（5）：65-67.