低分子凝膠M2和交聯透明質酸作為可注射性軟骨再生支架的可行性研究

殷宗琦 李 萍 李 丹 劉浥 汪振星 劉 豫 馮傳良 周廣東

低分子凝膠M2和交聯透明質酸作為可注射性軟骨再生支架的可行性研究

殷宗琦 李 萍 李 丹 劉浥 汪振星 劉 豫 馮傳良 周廣東

目的探討以低分子量凝膠M2和交聯透明質酸（Hyaluronic acid，HA）作為可注射性支架材料，在裸鼠體內構建組織工程軟骨的可行性。方法常規分離、體外單層培養新生豬耳軟骨細胞，將獲得的軟骨細胞以50×106cells/mL和100×106cells/mL的濃度分別與M2凝膠混合，以100×106cells/mL的濃度與交聯HA混合，分別注射于裸鼠皮下，并于8周后取材。以單純M2凝膠及單純HA作為對照組。通過大體觀察、組織化學檢查、濕重測定、力學檢測、蛋白聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）含量測定，判斷低分子量凝膠M2及交聯透明質酸在體內形成軟骨的能力。結果實驗組3組均可形成軟骨樣組織塊。其中，M2+高濃度細胞組體積最大、質地較硬、表面光滑，軟骨細胞位于成熟的陷窩中；M2+低濃度細胞組形成與高濃度細胞組質地相似的組織塊，但體積相對較小；HA組形成不成熟的組織塊，硬度差，含有的細胞數和分泌的基質最少。同時，實驗組3組的力學和GAG含量結果也證實M2+高濃度細胞形成的軟骨更加成熟。各組間具有顯著性差異。2個對照組未有類軟骨組織形成。結論低分子凝膠M2與軟骨細胞的生物相容性優于交聯HA，更適合作為可注射性支架材料用于組織工程化軟骨的構建。

低分子凝膠交聯透明質酸可注射支架材料組織工程化軟骨

軟骨損傷的修復是臨床治療的難題，組織工程為軟骨修復提供了新的可能，其中支架材料是關鍵問題之一。近年來，微創手術發展迅速，可注射性支架材料將成為與之匹配的理想選擇。可注射軟骨是指通過組織工程學方法，使細胞與可注射的支架材料混合，形成細胞-材料復合物后，將其注射到體內特定部位形成軟骨組織，達到修復軟骨缺損或局部填充美容塑形的目的。可注射軟骨將具備操作簡單、微創或無創，較易填補不規則缺損等優點，因而成為軟骨組織工程的研究熱點之一[1]。

目前，用于可注射軟骨研究的材料主要為凝膠類，如膠原、纖維蛋白、透明質酸（Hyaluronic acid，HA）、海藻酸鹽、瓊脂糖[2-3]和氧化聚乙烯[4]等。其中，HA是最常用的可注射性支架材料之一[5-7]，但存在降解過快、力學性能較差等問題。通過交聯的方法可以提高HA的力學強度，延緩其降解速度，但交聯后是否仍然適合作為可注射性軟骨再生支架，目前尚無系統的研究報道。因此，本研究以新生豬耳軟骨細胞為種子細胞，分別與交聯HA及低分子水凝膠M2（我們與上海交通大學材料科學與工程學院合作研發）混合，比較這兩種材料在體內構建組織工程軟骨的效果，以探討其作為構建可注射性軟骨再生支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

軟骨細胞取自1周齡貴州香豬（上海甲干生物科技有限公司）。實驗使用BALB/c裸鼠，共15只，6～8周，雄性，由上海實驗動物資源中心（西普爾-必凱公司）提供。

1.2 實驗試劑和儀器

高糖DMEM培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；NB4膠原酶（Sigma公司，美國）；細胞計數試劑盒（CCK-8，東仁化學科技有限公司，上海）；低分子量凝膠M2粉劑（上海交通大學材料科學與工程學院，上海）；交聯HA（組織工程國家工程研究中心，上海）。

1.3 軟骨細胞的分離培養及擴增

1.3.1 新生豬原代耳軟骨細胞獲取和培養

常規方法獲取豬耳軟骨細胞[8]，以1×104cells/cm2的密度接種于100 mm培養皿內，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每3天換液一次。原代軟骨細胞生長達到70%～80%融合后，以0.25%的胰蛋白酶消化傳代，按上述條件繼續培養及傳代。

1.3.2 細胞生長曲線

[9]的方法，用細胞計數試劑盒測量第1代到第3代細胞在第1、3、5、7、9天的OD值繪制成細胞生長曲線。

1.4 支架材料制備及生物學性狀觀察

分別制備與體內注射等量的支架材料：用1 mL二甲基亞砜（DMSO）溶解150 mg M2粉劑，制成M2溶液，取40 μL M2溶液與960 μL生理鹽水混勻，形成M2低分子量凝膠。將M2凝膠與交聯HA分別置于小玻璃瓶中，觀察其生物學性狀。

1.5 組織工程軟骨構建

取第3代的軟骨細胞，離心棄上清液后，分為3個實驗組和2個支架對照組，分別在裸鼠體內構建組織工程軟骨。實驗組：①M2凝膠混合高濃度細胞組（M2+100），將細胞與M2凝膠混勻，使細胞在凝膠中的終濃度為100×106cells/mL；②M2凝膠混合低濃度細胞組（M2+50），細胞與M2凝膠混勻，使其在凝膠中的終濃度為50×106cells/mL；③交聯HA混合高濃度細胞組（HA+100），將細胞與HA混勻，使細胞在HA中的終濃度為100×106cells/mL。上述3組均將凝膠細胞混合物注射于裸鼠脊柱兩側腹部皮下，每點注射0.2 mL。支架對照組：①單純M2凝膠組（M2）；②HA組。注射方法同實驗組。各組均為3只裸鼠，共6個注射點。

1.6 大體觀察和濕重測定

注射后8周取材，剝離表面的包膜，進行大體觀察及濕重測量。

1.7 生物力學檢測

用直徑為5 mm的角膜環鉆隨機切取組織工程化軟骨樣本，均修剪成高度為1 mm的圓形標本，以最大負荷450 N，1 mm/min的位移速度加壓，計算彈性模量。

1.8 蛋白聚糖（Glycosaminaglycan，GAG）含量測定

參照文獻[10]的方法，采用Alcian Blue法檢測再生軟骨組織中的GAG含量。以硫酸軟骨素標準品（Sigma公司，美國）繪制標準曲線，根據酶標儀比色結果（波長為600 nm）與標準曲線，計算GAG含量。

1.9 組織學檢測

將標本固定于4%多聚甲醛24 h，脫水、石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），進行蘇木素-伊紅染色及番紅-O染色，觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。

1.10 統計學分析

體內再生組織濕重、生物力學性能、GAG含量等定量指標以x±s表示（n=6），統計采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。統計軟件包為SPSS 12.0。

2 結果

2.1 支架材料生物學性狀觀察

近年來，揚州市食品藥品監督管理局稽查處勇于擔當，積極作為，成功查處了一批在全國有影響的大案要案，5次受到國家總局表彰，8次受到省局表彰，稽查工作在全國位居前列。央視《焦點訪談》先后2次進行專題報道，該處被群眾贊譽為保障食品藥品安全的“鋼刀利劍”。

交聯HA（圖1A）和低分子量水凝膠M2（圖1C）的原料均為白色粉末狀。制備后的交聯HA為無色透明的凝膠狀（圖1B），M2水凝膠為乳白色半透明團塊（圖1D）。

圖1 材料大體觀Fig.1 Gross view of materials

2.2 軟骨細胞形態及生長曲線觀察

原代軟骨細胞接種后12～24 h貼壁，48 h后開始增殖、分化。軟骨細胞剛貼壁時仍為圓形，逐漸伸展后呈三角形或多角形，細胞排列緊密，折光性強。傳代后生長速度加快。不同代次的軟骨細胞光鏡下均呈現良好的形態特征（圖2A-C），生長曲線結果表明不同代次的軟骨細胞的擴增能力無明顯差異（圖2D）。

圖2 不同代次軟骨細胞形態學觀察及生長曲線（40×）Fig.2 Morphological observation of chondrocytes in different passage and their growth curve(40×)

2.3 再生軟骨組織檢測

2.3.1 大體觀察

3個實驗組均可形成軟骨樣組織塊，以M2+100組體積最大、質地較硬、表面光滑，有細膩光澤，呈瓷白色，有一定的硬度和彈性，組織致密，中央未出現空心現象（圖3A、B）；M2+50組形成具有與高濃度細胞組相似質地的軟骨組織塊，但體積相對較小（圖3E、F）；而HA+100組形成的軟骨組織較不成熟且硬度較差，剖面觀出現空心現象，含有部分未降解的HA和水分（圖3I、J）。單純M2凝膠注射組在體內已完全降解，無法取材。單純交聯HA注射組未完全降解，材料被結締組織所包裹，未見類軟骨樣組織形成。

圖3 體內再生軟骨大體觀和組織學觀察Fig.3 Gross view and histological observation of regenerated cartilage in vivo

2.3.2 組織學檢測

2.3.3 組織濕重、生物力學及GAG含量檢測

M2+100、M2+50和HA+100三組的平均濕重分別為（179±9）mg、（146±11）mg、（170±10）mg；楊氏模量分別為（14.75±0.425）MPa、（12.89±0.374）MPa、（7.14±0.539）MPa；GAG含量分別為（38.03±2.743）mg/g、（33.29±3.536）mg/g、(12.24±1.386)mg/g。統計結果表明，M2+100組濕重和彈性模量顯著高于M2+50組（P＜0.05），提示細胞接種密度對再生軟骨的質和量均有重要影響。M2+100組和M2+50組楊氏模量、GAG含量均顯著高于HA+100組（P＜0.05），提示M2組再生軟骨的質量和力學性能均優于交聯HA組，表明低分子凝膠M2較交聯HA更適合作為可注射軟骨再生支架。HA+100組能維持較大的組織濕重可能是由于組織內部形成的空洞結構中帶有較多水分所致（圖4）。

圖4 各組濕重、楊氏模量和GAG含量Fig.4 Wet weight,Young's modulus and GAG content in each group

3 討論

組織工程軟骨研究和應用中，支架材料是重要的研究內容之一。優良的支架材料應具有良好的生物相容性、可降解性，組織細胞能較好地附著于材料支架并增殖分化形成功能性組織，材料在被降解吸收的同時可為新生組織所替代，并且適合于臨床應用的實際需要。與特定形態的聚合物支架材料相比，可注射的生物材料與細胞均勻混合后,可注射到不規則的缺損區，創傷小，方法簡單，安全有效，同時也符合現代美容整形領域對微創的要求，因此可注射型軟骨成為軟骨組織工程應用研究的重要發展方向。

目前,臨床研究中最常用的可注射生物材料為透明質酸。透明質酸又名玻璃酸，是一種高分子非蛋白質酸性黏多糖。透明質酸易溶于水而形成黏彈性流體，但力學性能較差，降解速度較快。因此，在機械強度及穩定性要求較高部位的應用受到限制。通過1,4丁二醇二縮水甘油醚（1,4-Butanediol diglycidyl ether，BDDE）交聯，可以顯著提高HA的力學性能，延緩其降解速率，交聯后的HA已廣泛用于面部除皺和體表軟組織缺損充填。但交聯后的HA作為可注射性軟骨再生支架的相關報道較少。本研究結果表明，交聯HA組形成的軟骨均質性、GAG含量和力學性能等均明顯劣于低分子凝膠M2組，特別是再生組織出現了明顯的空心現象。導致這一結果的可能原因包括：①交聯HA作為高分子凝膠，流動性較差，細胞在接種時很難混合均勻，因此形成的軟骨不均質；②注射到體內后，由于復合物外周營養充分，軟骨形成較快，外周軟骨形成后會導致中心營養滲透障礙，因而容易出現中央空心現象；③交聯HA降解速率過慢，大量HA殘留占據了物理空間，不利于軟骨細胞外基質再生和重塑，影響了再生軟骨的均質性和軟骨基質含量。因此，我們認為交聯HA并非理想的可注射性軟骨再生支架，適當降低交聯程度，改善其流動性及降解速率可能有助于提高其軟骨再生效果。

本研究應用的M2材料屬于低分子凝膠，是基于合成苯環結構結合天然氨基酸制備的復合材料，同時具備合成材料的可控性和天然材料優良的生物相容性。該材料分子可設計性強，靈活度高，可根據細胞種類的不同，而選擇不同的制備性能以滿足不同的需求。例如，可以在低分子凝膠體系加入海酸藻鈉來進一步提高其力學特性，并通過調節其鈣離子含量來調節強度以滿足不同種類細胞及不同功能應用的需要。另外，低分子量凝膠結構內部空間較大，降解速率適中，便于在軟骨再生過程中為營養物質、生長因子及其他可溶性分子的擴散提供足夠的空間，從而較好地維持細胞的活性，利于細胞的生長增殖和組織再生。本實驗結果證明，M2加高濃度細胞組的標本體積最大、質地較硬、表面光滑，軟骨細胞位于成熟的陷窩中；M2加低濃度細胞組形成與高濃度細胞組質地相同的組織塊，但體積相對較小。這說明與HA相比，M2材料運用于軟骨構建時，所形成的組織工程軟骨質量較好，同時在力學強度等方面也具有更大的優越性。M2作為可注射性材料，在構建組織工程軟骨方面具有很大的應用潛力。

但是，本實驗僅在裸鼠體內對該凝膠成軟骨的能力進行了分析，沒有深入地對材料的生物安全性進行檢測。在后續的實驗中，我們將對該材料進行深入的研究，并建立大動物模型。

4 結論

交聯HA與軟骨細胞復合形成的軟骨不均質，力學性能差，不是理想的可注射型軟骨再生支架；低分子量凝膠M2與軟骨細胞復合，可形成均質成熟的軟骨組織，再生軟骨具有較高的軟骨基質含量和力學性能，是較為理想的新型可注射型軟骨再生支架。

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Low-Molecule-Weight Hydrogel M2 and Cross-Lincked Hyaluronic Acid as Injectable Cartilage Regeneration Scaffolds

YIN Zongqi1,LI Ping2,LI Dan1,LIU Yi1,WANG Zhenxing1,LIU Yu1,FENG Chuanliang2,ZHOU Guangdong1.

1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200041,China;2 Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China.Corresponding author:Zhou Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of low-molecule-weight hydrogel M2 and cross-lincked hyaluronic acid (HA)as injectable materials for cartilage tissue engineering in nude mice.MethodsThe auricular chondrocytes of newborn pig were isolated and expanded.The cells were mixed with M2 hydrogel in 50×106cells/mL and 100×106cells/mL,and were mixed with HA in 100×106cells/mL,followed by subcutaneous injection into nude mice.M2 hydrogel and HA were also injected as control groups.After 8 weeks,the samples were harvested and evaluated for cartilage formation by gross view, histochemical examination,wet weight test,mechanical analysis and glycosaminoglycan(GAG)quantification.Results All three groups formed cartilage-like tissues.Samples in M2 group with high cell density(100×106cells/mL)were the largest in size with stiffest texture,smoothest surface,and most abundant lacuna structures.Samples in M2 group with low cell density (50×106cells/mL)also formed cartilage-like tissue with stiff texture,but their size shrank obviously;HA group,however, formed immature cartilaginous tissue with poor rigidity,cellularization and cartilage specific matrix expression.Thecorresponding quantitative data further demonstrated that samples in M2 group with high cell density had the highest GAG content and strongest mechanical property.Statistically significant differences were observed among 3 groups.No cartilagelike tissue were formed in the 2 control groups.ConclusionLow-molecule-weight hydrogel M2 has better biocompatibility than hyaluronic acid,and M2 can be more suitable for TE cartilage construction.

Low-molecule-weight hydrogel;Cross-lincked hyaluronic acid;Injectable scaffold; Tissue engineering cartilage

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）06－0305－05

2014年10月14日；

2014年11月5日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.002

國家高技術發展計劃重大專項（863項目，2012AA020507）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室；200041上海市組織工程國家工程研究中心（殷宗琦，李丹，劉浥，汪振星，劉豫，周廣東）；200240上海市上海交通大學材料科學與工程學院（李萍，馮傳良）。

周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。