軟骨形態發生蛋白1誘導的瘢痕成纖維細胞體內成軟骨能力的實驗研究

沈聰聰 柴 崗 曲 淼 侯亦康 許祐榮 張 艷

軟骨形態發生蛋白1誘導的瘢痕成纖維細胞體內成軟骨能力的實驗研究

沈聰聰 柴 崗 曲 淼 侯亦康 許祐榮 張 艷

目的探討軟骨形態發生蛋白1（CDMP1）誘導的瘢痕成纖維細胞在體內環境下的軟骨構建能力。方法取瘢痕切除術后丟棄的增生性瘢痕組織，提取瘢痕成纖維細胞。將瘢痕成纖維細胞與PGA/PLA支架復合，CDMP1軟骨誘導液（CDMP1終濃度為100 ng/mL）進行誘導培養2周，設為誘導組（n=10）；將常規培養液培養的瘢痕成纖維細胞－材料復合物植入裸鼠體內作為陰性對照，設為非誘導組（n=4）；將軟骨細胞－材料復合物植入裸鼠體內作為陽性對照，設為軟骨組（n=4）。分別于4周和8周后取材，進行各組濕重、糖胺聚糖（GAG）含量測定，HE染色、Safranine-O染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色。結果體內培養4周、8周后各組濕重、GAG含量測定顯示，誘導組均高于非誘導組（P＜0.05）。體內培養4周后，誘導組HE染色結果顯示，瘢痕成纖維細胞誘導后出現軟骨細胞陷窩結構；Safranine-O染色結果示，GAG均勻分布于基質；免疫組織化學染色示部分瘢痕成纖維細胞基質中COLⅡ陽性表達。8周時，誘導組的類軟骨結果相對4周時更加成熟，更加符合軟骨結構分布。結論在CDMP1誘導下，瘢痕成纖維細胞與PGA/PLA材料復合，在體內可以形成類軟骨組織，具備一定的成軟骨能力。

瘢痕成纖維細胞軟骨細胞軟骨形態發生蛋白1誘導分化

軟骨缺損的治療一直是整形外科面臨的嚴峻問題。目前，臨床上常用的替代治療手段均存在許多問題。自體軟骨細胞移植修復也存在細胞供區不足、體外培養周期長、供區易發生病變和軟骨細胞表型不易保持等缺點。組織工程技術的建立為修復和替代受損組織提供了一種新的方法。

研究發現，真皮成纖維細胞具有多向分化潛能[1]，并能誘導成軟骨細胞[2-3]。大面積燒傷伴軟骨缺損的患者，皮源緊張，但有大量廢棄的瘢痕組織，而瘢痕成纖維細胞與皮膚成纖維細胞同樣具有強大的體外增殖能力及基質分泌能力，能夠分泌大量膠原及細胞外基質，為軟骨組織構建提供了契機。

本研究的前期實驗已經證明，瘢痕成纖維細胞在體外單層培養和三維環境下均可向軟骨細胞表型分化，并具備一定的軟骨分化潛能[4]。在本實驗中，我們將瘢痕成纖維細胞與PGA/PLA生物材料的復合物植入體內，探討其在體內環境下的成軟骨能力。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Ⅰ型膠原酶（Worthington公司，美國）；FBS基礎培養液、DMEM培養液（Hyclone公司，美國）；胰蛋白酶（上海實生生物制品有限公司）；CDMP1（Research Diagnostics公司，美國）；鼠抗人I型膠原單克隆抗體、羊抗鼠二抗（Santa公司，美國）。

恒溫CO2培養箱（Forma Scientific公司，美國）；普通臺式離心機、高速冷凍離心機（Heraeus公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；電泳儀（天能科技有限公司）；熱循環儀（Biometra公司，美國）；100 mm培養皿、離心管（FALCON公司，美國）。

1.2 取材與細胞培養

取我科手術切除瘢痕3例（1名男性，2名女性，年齡7～20歲，獲患者知情同意），超凈臺內去除表皮及皮下組織，剩余瘢痕增生部分剪碎移入離心管，加入10倍體積的0.3%Ⅰ型膠原酶，37℃、3 h、100目細胞濾器過濾后離心，2 000 r/min，10 min，棄上清，加入10%FBS的DMEM培養液混浴，接種至100 mm的培養皿。待細胞融合至80%時，以1×104cells/cm2密度傳代，體外擴增至第4代進行培養。

取手術廢棄的部分肋軟骨（獲患者知情同意），分離軟骨細胞常規培養。

1.3 PGA/PLA支架材料的制作

取無紡PGA纖維加入1.5%的PLA二氯乙烷溶液約0.4 mL，待其自然干燥后取出，真空保存備用。

1.4 細胞接種和誘導

配制CDMP1誘導液（2%胎牛血清F-12培養液，CDMP1終濃度為100 ng/mL）。各組細胞懸液0.3 mL均勻種植于PGA/PLA支架上，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度下培養4～5 h后，加入含10%FBS的LG-DMEM培養液繼續培養。3 d后換為軟骨誘導液誘導培養2周。同時，制備軟骨細胞-材料復合物。

1.5 實驗動物分組和手術回植

6周齡雄性裸鼠20只，麻醉意外死亡2只，共18只用于實驗。將CDMP1體外誘導后的細胞材料復合物植入裸鼠體內，為誘導組，10只；將常規培養液培養的細胞－材料復合物植入裸鼠體內作為陰性對照，為非誘導組，4只；將軟骨－細胞材料復合物植入裸鼠體內作為陽性對照，為軟骨組，4只。隨機分組，裸鼠背部表面麻醉，正中作約1 cm長度切口，向兩側分離，使皮膚與皮下組織分離，將體外培養的細胞－材料復合物植入裸鼠皮下，左側為實驗組，右側陰性對照組，背部中央為陽性對照組，絲線縫合傷口。

1.6 術后大體觀及濕重測定

分別于4周和8周后取材，比較各組標本大小、外形及彈性，并對各組標本濕重進行測量。

1.7 GAG含量測定

取材后對細胞－材料復合物進行檢測，將復合物于去污裂解液中剪碎，經鹽酸胍等處理后，以阿利辛藍染色并沉淀，經DMSO溶解后在600 nm波長下測定其吸光度值，以硫酸軟骨素繪制標準曲線，根據比色結果與標準曲線，計算樣本內GAG的含量。

1.8 組織學和免疫組織化學染色

取材后收集樣本，10%磷酸緩沖福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。以HE、safranin-O染色及免疫組化染色，分別顯示復合物的組織學形態和軟骨特異指標的分布。

1.8.1 HE染色

切片脫蠟入水后，PBS漂洗，蘇木素染色20 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化，再水洗脫水，伊紅染料染色，乙醇梯度脫水，樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.8.2 Safranin-O染色

取材后，切片脫蠟至水，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化5 sec（提插數下），自來水沖洗15 min，Safranin-O染色10 min，快速水洗20 sec，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.8.3 免疫組織化學

將切片脫蠟至水；PBS漂洗3次，3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶，PBS漂洗，0.4%胃蛋白酶（pH 2.0）37℃消化30 min，正常羊血清（用1% BSA進行1∶10稀釋）室溫下孵育30 min封閉非特異性抗原；加入鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（1% BSA 1∶100稀釋）4℃過夜，PBS漂洗；加入HRP標記羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗；加入二氨基聯苯氨（DAB）顯色；蘇木素復染，中性樹脂封片。以不加鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體作為空白對照，正常軟骨組織為陽性對照。

1.9 統計學處理

結果數據以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05認為差異有統計學意義。統計軟件為SPSS v1.15。

2 結果

2.1 細胞材料復合物大體觀及濕重檢測

大體觀察：體內培養4周后，所有的復合物均變得相對光滑，外觀光澤。誘導組與非誘導組稍有皺縮，基本保持了材料的原有形態。誘導組直徑約4.5 mm，形狀良好，觸之有一定彈性；非誘導組雖能保持一定外觀，但基質分泌較少，韌性較差，質地較松軟；軟骨組生長良好，基質分泌旺盛，形狀規則，外觀均呈乳白色，有彈性。濕重測定示，軟骨組為92.75±1.53 mg，誘導組為75.69±0.97 mg，非誘導組為43.21±0.43 mg，3組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。

體內培養8周后，誘導組呈現特有的軟骨光澤，較體內培養4周有所成熟；非誘導組質地松軟，生長欠佳；軟骨組生長良好。濕重測定示，軟骨組為101.24±2.53 mg，誘導組為80.09±1.27 mg，非誘導組為35.15±2.03 mg，3組差異顯著（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 細胞材料復合物體內培養4周后大體觀及濕重測定Fig.1 Gross view and the wet weight of HSFBs-PGA/PLA complex in each group after cultured for 4 weeks in vivo

圖2 細胞材料復合物體內培養8周后大體觀及濕重測定Fig.2 Gross view and the wet weight of HSFBs-PGA/PLA complex in each group after cultured for 8 weeks in vivo

2.2 GAG定量檢測

HSFBs-PGA/PLA復合物植入體內4周、8周后行GAG含量測定。結果顯示，誘導組GAG含量均明顯高于非誘導組，誘導組與非誘導組差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 體內培養4、8周后各組GAG定量檢測Table1 GAG content in each group after cultured for 4 or 8 weeks in vivo

2.3 組織學和免疫組織化學染色

2.3.1 HE染色

細胞－材料復合物體內培養4周后取材，HE染色顯示，軟骨組與正常軟骨組織的組織學特征十分接近，形成了成熟連續的軟骨組織，可見到大量成熟的軟骨陷窩，無纖維組織形成，但新生軟骨內部的組織結構均較周邊松散，可見到尚未降解的支架材料。誘導組細胞材料復合物以纖維性組織為主，較為緊密，部分區域可見到軟骨樣組織，部分細胞出現陷窩結構；非誘導組呈現均一的纖維樣結構，組織結構松散，鏡下未發現軟骨特征性陷窩結構。體內培養8周后HE染色顯示，誘導組部分細胞出現陷窩結構，非誘導組鏡下未發現軟骨特征性陷窩結構（圖3）。

圖3 細胞-材料復合物體內培養4周后各組組織學及免疫組織化學觀察Fig.3 Histological and immunohistochemical observation of each group after culturing for 4 weeks in vivo

2.3.2 Safranine-O染色

細胞－材料復合物誘導4周后取材，Safranine-O染色顯示，誘導組陽性染色，著色均一，相對軟骨組著色稍淺；非誘導組著色陰性；軟骨組著色呈強陽性，著色均一，提示大量GAG分泌。8周后取材行Safranine-O染色，軟骨組著色均一，強陽性；誘導組均勻染色，相對軟骨組著色稍淺，提示GAG均勻分布于基質；非誘導組著色陰性（圖3）。

2.3.3 免疫組織化學染色檢測

細胞－材料復合物誘導4周后取材，免疫組織化學染色顯示誘導組部分區域出現陽性著色，著色相對不均一，提示部分瘢痕成纖維細胞出現COLⅡ的表達；非誘導組免疫組化染色呈現陰性結果；軟骨組染色結果呈陽性，著色均勻。誘導8周后，誘導組部分區域著色陽性；非誘導組免疫組化染色呈陰性；軟骨組細胞染色強陽性，著色均勻（圖4）。

圖4 細胞-材料復合物體內培養8周后各組組織學及免疫組織化學觀察Fig.4 Histological and immunohistochemical observation of each group after culturing for 8 weeks in vivo

3 討論

由于軟骨的再生能力很有限，軟骨缺損的修復一直是臨床治療的難題。傳統的治療方法，如軟骨下打孔、骨髓刺激法、軟骨膜移植法或使用人工代用品都存在一定的缺點，并不能完全修復透明軟骨的原有結構。組織工程的發展，使組織構建成為可能，為軟骨缺損的修復提供了新的方法及思路。

綜合考慮來源、取材的創傷以及誘導分化的效率問題，我們需要尋找一種來源廣泛，能夠向軟骨細胞誘導分化，而且更容易為患者所接受的種子細胞。真皮成纖維細胞在機體分布廣泛、取材方便、增殖力強，已成為當前組織工程種子細胞研究的重點[5]。與軟骨細胞不同的是，真皮成纖維細胞保留了中胚層間質細胞增殖力強的特性，多次傳代后仍能保持強大增殖力。對于臨床上大面積燒傷伴軟骨缺損的患者而言，患者皮源緊張，無多余皮膚可取，切取正常皮膚亦會增加感染風險，患者很難接受。研究證明，瘢痕成纖維細胞（HSFBs）與DFs同樣具有強大的體外增殖能力及基質分泌能力，能夠分泌大量膠原及蛋白聚糖。同時，HSFBs具有部分干細胞的特性，在特定條件下能夠表達干細胞相關標志物。Yang等[6]提取瘢痕疙瘩中的成纖維細胞，在特定誘導條件下發現瘢痕成纖維細胞具有干細胞樣分化潛能，能夠表達神經角質細胞相關標志物，并能夠向神經細胞分化誘導。Moon等[7]從頭皮瘢痕中分離瘢痕成纖維細胞，采用各種誘導體系對瘢痕成纖維細胞進行培養誘導，結果顯示瘢痕成纖維細胞能夠表達間充質干細胞的標志物CD13、CD29、CD44、CD90等，并能夠向骨組織細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌腱細胞及上皮細胞等方向分化，證明了瘢痕成纖維細胞具有多向分化潛能。

軟骨形態發生蛋白（CDMP1，cartilage-derived morphogenetic protein1）是骨形態發生蛋白（BMP，bone morphogenetic protein）家族中的一類特異性生長因子，是與軟骨形態發生和發育最為相關的一類生長因子，CDMP1主要通過調節間質前體細胞的分化，參與正常軟骨組織的生長并促進軟骨損傷的修復過程[8-9]。研究表明，CDMP1能夠誘導間充質干細胞向軟骨表型分化并表達特異性軟骨基質[10]，而瘢痕成纖維細胞具有間充質干細胞的特性，具有向軟骨細胞分化的潛能。因此，本實驗采用軟骨形態發生蛋白作為誘導劑。而進行組織工程軟骨構建，生物支架材料是必不可少的一個因素。支架材料對軟骨組織的形成具有重要作用，它能夠為細胞提供一個穩定的三維空間結構，便于細胞黏附生長[11]。理想的支架材料應具備以下特點[12]：良好的生物相容性，良好的生物降解性，具有三維立體多孔結構，以及一定的可塑性和機械強度。Grande等[13]的研究發現，PGA/ PLA支架材料具有促進蛋白聚糖合成，促進軟骨細胞增殖、分化和基質合成的作用。

本研究中，細胞-材料復合物體內培養4周后，大體觀察發現，軟骨組外觀類似于軟骨組織，基質分泌旺盛，皺縮不明顯，有彈性，外形尚基本保持。誘導組外觀良好，稍有皺縮，觸之略有彈性，但相對軟骨組稍差，組織塊直徑及厚度略有減小，外形尚能保持；非誘導組細胞材料復合物皺縮變形，結構相對松散，厚度也明顯變薄，無法保持原有外形，彈性較差，與軟骨組差距明顯。8周標本大體觀發現，誘導組基質進一步增加，外觀良好，相對4周而言，軟骨光澤及光滑程度明顯增加。而非誘導組雖重量和光滑程度增加，但結構相對松散，彈性較差，抗外力能力明顯不足。各組細胞-材料復合物的濕重及GAG含量檢測表明，隨著體內培養時間的延長，各組濕重及GAG含量均進一步增加，而誘導組在濕重及GAG定量測定中均優于非誘導組，差異有統計意義。4周取材HE染色顯示，軟骨組與正常軟骨組織的組織學特征十分接近，形成了連續的軟骨組織，可見到大量的軟骨陷窩，軟骨細胞之間大量基質分泌，無明顯纖維組織形成。誘導組細胞材料復合物結構較為緊密，部分區域可見到軟骨樣組織，細胞出現陷窩結構，陷窩結構在細胞材料復合物邊緣多于中央，中央大部分區域仍可見到大量纖維組織形成；非誘導組呈現彌散的纖維性組織，組織結構松散，鏡下未發現明顯軟骨特征性陷窩結構。8周標本相對4周標本而言更為成熟，細胞間基質增加，誘導組結構更加緊密，軟骨陷窩數量增多，陷窩結構更加明顯，更加符合軟骨結構分布。非誘導組未見到明顯變化，仍為纖維性結構為主，未見軟骨組織特征性結構出現。COLⅡ為軟骨細胞特異標志物，對細胞材料復合物體內培養4周后進行COLⅡ免疫組織化學染色，誘導組部分區域出現陽性著色，著色相對均一，提示部分瘢痕成纖維細胞出現COLⅡ的表達；非誘導組免疫組化染色結果呈現陰性結果，未有COLⅡ的表達；軟骨組細胞染色結果呈陽性，整個細胞材料著色均勻，提示COLⅡ的高度表達。體內培養8周細胞材料復合物COLⅡ免疫組織化學染色結果表明，誘導組部依然為陽性著色，著色均一，與非誘導組的陰性結果形成明顯對比。Safranine-O染色的結果同樣驗證了上述結果。

本實驗結果表明，在CDMP1誘導下，瘢痕成纖維細胞在體內可以形成類軟骨組織，具備一定的體內成軟骨能力，經過4周誘導后瘢痕成纖維細胞形成的類軟骨組織相對成熟，體內培養8周后的細胞材料復合物較4周更加成熟，雖然與正常軟骨仍有一定差距，但在外形和結構上更加接近軟骨組取材標本。隨著培養時間和實驗條件的改善，瘢痕成纖維細胞有望在體內構建更加成熟穩定的軟骨組織，成為軟骨構建的種子細胞來源之一。

[1]Huang HI,Chen SK,Ling QD,et al.Multilineage differentiation potential of fibroblast-like stromal cells derived from human skin [J].Tissue Eng Part A,2010,16(5):1491-1501.

[2]Yin S,Cen L,Wang C,et al.Chondrogenic transdifferentiation of human dermal fibroblasts stimulated with cartilage-derived morphogenetic protein 1[J].Tissue Eng Part A,2010,16(5):1633-1643.

[3]Zhao G,Yin S,Liu G,et al.In vitro engineering of fibrocartilage using CDMP1 induced dermal fibroblasts and polyglycolide[J]. Biomaterials,2009,30(19):3241-3250.

[4]馬曉飛,張艷,柴崗,等.軟骨形態發生蛋白1誘導瘢痕成纖維細胞表達軟骨表型的實驗研究[J].組織工程與重建外科,2012,8 (2):78-83.

[5]崔磊,尹爍,鄧辰亮,等.軟骨形態發生蛋白1誘導真皮成纖維細胞表達軟骨細胞表型的實驗研究[J].中華醫學雜志,2004,84 (15):1304-1309.

[6]Yang JH,Shim SW,Lee BY,et al.Skin-derived stem cell in human scar tissues:a novel isolation and proliferation technique and their differentiation potential to neurogenic progenitor cells[J]. Tissue Eng Part C,2010,16(4):619-629.

[7]Moon JH,Kwak SS,Park G,et al.Isolation and characterization of multipotent human keloid-deriv ed mesenchymal-like stem cells[J].Stem Cells Dev,2008,17(4):713-724.

[8]Felin JE,Mayo JL,Loos TJ,et al.Nuclear variants of bone morphogenetic proteins[J].BMC Cell Biol,2010,11:20.

[9]Tsumaki N,Tanaka K,Arikawa-Hirasawa E,et al.Role of CDMP-1 in skeletal morphogenesis:promotion of mesenchymal cell recruitment and chondrocyte differentiation[J].J Cell Biol, 1999,144(1):161-173.

[10]Bai X,Xiao Z,Pan Y,et al.Cartilage-derived morphogenetic protein-1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,325 (2):453-460.

[11]Vacanti CA,Langer R,Schloo B,et al.Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation [J].Plast Reconstr Surg,1991,88(5):753-759.

[12]Boyan BD,Hummert TW,Dean DD,et al.Role of material surfaces in regulating bone and cartilage cell response[J]. Biomaterials,1996,17(2):137-146.

[13]Grande DA,Halberstadt C,Naughton G,et al.Evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts [J].J Biomed Mater Res,1997,34(2):211-220.

ChondrogenicDifferentiationofHypertrophicScar-DerivedFibroblastsInitiatedbyCartilage-derived Morphogenetic Protein 1 in Vivo

SHEN Congcong,CHAI Gang,QU Miao,HOU Yikang,XU Yourong,ZHANG Yan.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,200011 Shanghai,China.Corresponding author:Zhang Yan(E-mail:13651817522@163.com).

ObjectiveTo explore the chondrogenesis potential of hypertrophic scar fibroblasts(HSFBs)induced by cartilage-derived morphogenetic protein 1(CDMP1)in vivo.MethodsHypertrophic scar fibroblasts(HSFBs)were isolated from discarded hypertrophic scar.HSFBs combining with PGA/PLA scaffold as HSFBs-PGA/PLA complex were induced by CDMP1(100 ng/mL)for 2 weeks.Then the complex were transplanted into nude mice as induced group(n=10).The complex that not induced were treated as negative control,named as un-induced group(n=4),while the chondrocytes-PGA/PLA complex were treated as positive control,named as chondrocyte group(n=4).After 4 and 8 weeks,the complex in each group was harvested for wet weight test,proteoglycan(GAG)content test,HE staining,Safranine-O staining and immunochemistry staining.ResultsAfter 4 and 8 weeks in vivo,the wet weight and GAG content in induced group were both higher than in un-induced group(P＜0.05).In induced group,after cultured for 4 weeks in vivo,chondrocyte-like lacuna structure was observed by HE staining,uniform distribution of GAG was observed by Safranine-O staining,and positive expression of collagen typeⅡwas revealed by immunohistochemical staining.After 8 weeks of culturing in vivo,chondrocyte-like structure in induced group was more mature and more in line with the structure distribution of cartilage.ConclusionHSFBs combining with PGA/PLA had the potential to develop into polygonal chondrocyte-like tissue by the induction of CDMP 1.

Hypertrophic scar fibroblasts;Chondrocytes;Cartilage-derived morphogenetic protein 1; Transdifferention

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）06－0324－05

2014年10月11日；

2014年11月6日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.006

上海市科委自然科學基金（12ZR1416900）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

張艷（E-mail：13651817522@163.com）。