煙草重要基因篇：6. 煙草抗蟲相關基因

徐蓬軍，宋鵬飛，任廣偉

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.河南農業大學，鄭州 450002）

煙草重要基因篇：6. 煙草抗蟲相關基因

徐蓬軍1，宋鵬飛2，任廣偉1

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.河南農業大學，鄭州 450002）

植物與植食性昆蟲在長期協同進化過程中形成了復雜的互作關系：昆蟲通過植物的生理和化學信號尋找寄主、取食和產卵，植物自身為抵抗昆蟲的為害相應地形成了多種防御體系，包括生理防御（通過長刺、延長表皮毛和加厚表皮等）和化學防御（利用次生代謝物）[1]。近年來，因化學農藥用于害蟲防治帶來的諸多環境安全問題，以植物次生代謝物為主的化學防御引起了學者的廣泛關注[1]。隨著現代分子生物學技術的發展，通過研究上述防御機制，人們獲得了多種植物源的抗蟲基因，并逐步用于害蟲防治[2]。煙草是世界上重要的經濟作物，由于病蟲害的大量發生，化學農藥的使用量不斷上升，這在一定程度上控制住了蟲害的發生，但長期大量使用農藥帶來了一系列問題，例如農藥殘留和環境污染等，因此挖掘抗蟲基因防治煙草害蟲成為害蟲防治的一種重要手段。多年來，研究者已證明煙草可產生一系列相關化學物質而具有一定的抗蟲性[3-7]。但在煙草抗蟲基因方面的研究還較少，主要集中在蛋白酶抑制劑基因、防御物質合成基因和信號途徑基因等方面。

1 蛋白酶抑制劑基因

植物蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor, PI）是一類能抑制蛋白酶活性的小分子蛋白或多肽，在植物防御病蟲害為害中起到重要的作用。昆蟲取食后，蛋白酶抑制劑可與昆蟲的蛋白水解酶相結合，抑制昆蟲對蛋白質的消化和吸收，另一方面會引起昆蟲蛋白酶的過量合成和分泌，干擾昆蟲的正常代謝。在煙草中目前只開展了胰蛋白酶抑制劑和糜蛋白酶抑制劑部分研究，證明蛋白酶抑制劑跟煙草的抗蟲性密切相關[8-9]。

2 防御物質合成的相關基因

2.1 氧化酶

活性氧的快速產生是植物應對病蟲害防衛反應的重要標志，在逆境脅迫下，植物體會通過氧化酶積累大量的活性氧、陰離子過氧化物等，將組織中的相關成分氧化成毒性物質[10]。煙草中的氧化酶同源基因Narboh D 的表達跟煙草體內活性氧的含量成正比[11]。

2.2 過氧化物酶

在植物體內，過氧化物酶在 H2O2的幫助下能催化單酚、二酚及芳香胺反應生成對生物具有高度毒性的醌，從而起到抗病蟲害的效果，植物在受到外力損傷的時候也相應地提高過氧化物酶基因的表達水平[12]。對煙草不同抗蟲品種的研究表明，抗蟲性越高其過氧化物酶及其同工酶的表達量及活性也越高[13-14]。

2.3 細胞色素氧化酶 P450

細胞色素氧化酶 P450 調節植物次生代謝合成中的許多反應，包括生物堿、脂肪酸的前體及苯基異丙酮和植物毒素等。植物遇到蟲害時，受害組織及其鄰近部位將提高 P450 的表達量和活性，改變代謝過程，從而合成更多的上述次生物質，使植物產生抗蟲性。煙草研究中表明，抑制細胞色素氧化酶 P450 水解酶基因的表達可顯著提高煙草對煙蚜的抗性[15]。

2.4 谷氨酸脫羧酶

γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyrate，GABA）是一種四碳非蛋白氨基酸，可通過 GABA 介導的氯離子通道阻止無脊椎動物的神經傳遞。受損植物可通過快速積累 GABA，從而對害蟲起到暫時的麻痹作用，達到抗蟲的效果[16]。GABA 由谷氨酸脫羧酶合成，蟲害可迅速誘導煙草谷氨酸脫羧酶基因的表達上調，從而增加 GABA 的含量[17-18]。

3 茉莉酸信號途徑

茉莉酸信號傳導途徑是指植物以茉莉酸（jasmonic acid，JA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）介導的防御系統[19]。植物被昆蟲為害后，通過茉莉酸信號途徑誘導合成具有毒殺作用的植物次生代謝物質，茉莉酸本身不具有殺蟲作用。茉莉酸信號途徑是目前煙草中研究最為詳細的植物防御系統，包括茉莉酸合成的上游調控基因、小分子物質以及主要合成酶等[20-25]。Wang 等[19]以煙草為模式生物，詳細敘述了茉莉酸生物合成途徑。昆蟲取食煙草時，其分泌物中的脂肪酸氨基酸合物(FACs)進入植物組織誘導植物激活水楊酸誘導蛋白激酶（SIPK）和損傷誘導蛋白激酶（WIPK），在這兩種蛋白激酶的共同作用下激活茉莉酸的合成：葉綠體內首先在質體甘油脂酶 A1（GLA1）的作用下生成 α-亞麻酸，α-亞麻酸在脂氧合酶（LOX3）、丙二烯合成酶（AOS）和丙二烯氧化環化酶（AOC）的共同催化作用下生成穩定的中間體 12-氧-二烯酸（OPDA），OPDA 隨后轉變為過氧物酶體，在 OPDA 還原酶（OPR3）和三步氧化還原反映下轉化為茉莉酸。植物茉莉酸合成受 SIPK 激酶、WIPK 激酶、NPR1 非表達因子、BAK1 受體激酶、谷胱甘肽還原酶(GSNOR)和 SKP1 等位基因抑制子(SGT1)的正調控，受 MPK4、CDPK4、CDPK5 激酶和 NOA1 蛋白的負調控。茉莉酸進一步在茉莉酸抗性 1(JAR)的作用下生成茉莉酸異亮氨酸，在茉莉酸羧基甲基轉移酶(JMT)作用下生成茉莉酸甲酯、順式茉莉酸和 12-羥基茉莉酸。茉莉酸異亮氨酸結合泛素連接酶 SCFCOI1 起始茉莉酸途徑負調控子的 JAZ 蛋白的降解。在無茉莉酸的條件下，JAZ 蛋白可與茉莉酸信號途徑的正向轉錄調控因子MYC2 相互作用。在內外信號的作用下，茉莉酸異亮氨酸合成后特異性與 COI1 結合，促進 COI1 和 JAZ蛋白的生理互作，導致 JAZ 蛋白在 26S 蛋白酶體的作用下降解，從而激活 MYC2 轉錄因子誘導尼古丁、蛋白酶抑制劑和 17-羥基四烯醇二萜糖苷等防御化合物的產生。

4 問題與展望

發展環境友好型的害蟲治理方法已成為現代植物保護研究的焦點，植物源抗蟲基因的開發和利用無疑是達到此目的的重要手段之一。目前，煙草抗蟲基因的研究相對落后，例如生物堿等重要的抗蟲基因未見相關研究，但是煙草全基因組測序的完成為挖掘煙草抗蟲基因奠定了堅實的基礎。基于此，利用以下兩種方法可快速地篩選煙草抗蟲基因進行理論和應用研究：（1）根據其他作物中已報道的抗蟲基因，篩選煙草同源基因，進行抗蟲性研究；（2）通過研究害蟲與煙草的互作關系，獲得抗蟲性材料，利用現代分子生物方法，例如芯片、RNA-seq 技術等[26]，分析獲得煙草抗蟲基因，并進行后續的理論和應用研究。隨著煙草抗蟲基因的深入研究，必將產生病蟲害防治的新方法用于煙草的安全生產。

[1]Wu J, Baldwin I T. New insights into plant responses to the attack from insect herbivores[J]. Annu Rev Genet, 2010, 44: 1-24.

[2]Hilder V A, Barker R F, Samour R A, et al. Protein and cDNA sequences of Bowman-Birk protease inhibitors from the cowpea (Vigna unguiculata Walp.)[J]. Plant Mol Biol, 1989, 13: 701-710.

[3]Johnson A W, Severson R F, Hudson J, et al. Tobacco leaf trichomes and their exudates[J]. Tobacco Sci, 1985, 29: 67-72.

[4]Severson R F, Johnson A W, Jachson D M. Cuticular constituents of tobacco: factors affecting their production and their role in insect and disease resistance and smoke quality[J]. Recent Adv Tobacco Sci, 1985, 11: 105-174.

[5]Thurston R, Webster J A. Toxicity of Nicotian agossei domin to Myzuspersicae (Sulzer) [J]. Entomol Exp Appl, 1962, 5: 233-238.

[6]Dixit S, Upadhyay S K, Singh H, et al. Enhanced methanol production in plants provides broad spectrum insect resistance[J]. PLoS One, 2013, 8: e79664.

[7]高熹，潘賢麗. 煙草抗蟲性研究進展[J]. 熱帶農業科學, 2004, 24(6): 59-67.

[8]Anderson M A, Van Heeswijck R, West J, et al. Proteinase inhibitors from Nicotiana alata enhance plant resistance to insect pests[J]. J Insect Physiol, 1997, 43: 833-842.

[9]Senthilkumar R, Cheng C P, Yeh K W. Genetically pyramiding protease-inhibitor genes for dual broad-spectrum resistance against insect and phytopathogens in transgenic tobacco[J]. Plant Biotechnol J, 2010, 8: 65-75.

[10]Sagi M, Davydov O, Orazova S, et al. Plant respiratory burst oxidase homologs impinge on wound responsiveness and development in Lycopersicon esculentum[J]. Plant Cell, 2004, 16: 616-628.

[11]Wu J, Wang L, Wunsche H, et al. Narboh D, a respiratory burst oxidase homolog in Nicotiana attenuata, is required for late defense responses after herbivore attack[J]. J Integr Plant Biol, 2013, 55: 187-198.

[12]Hiraga S, Ito H, Sasaki K, et al. Wound-induced expression of a tobacco peroxidase is not enhanced by ethephon and suppressed by methyl jasmonate and coronatine[J]. Plant Cell Physiology, 2000, 41: 165-170.

[13]Dowd P F, Holmes R A, Pinkerton T S, et al. Relative activity of a tobacco hybrid expressing high levels of a tobacco anionic peroxidase and maize ribosome-inactivating protein against Helicoverpa zea and Lasioderma serricorne[J]. J Agric Food Chem, 2006, 54: 2629-2634.

[14]Dowd P F, Lagrimini L M, Nelsen T C. Relative resistance of transgenic tomato tissues expressing high levels of tobacco anionic peroxidase to different insect species[J]. Nat Toxins, 1998, 6: 241-249.

[15]Wang, E, Wang R, DeParasis J, et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances natural-product-based aphid resistance[J]. Nat Biotechnol, 2001, 19: 371-374.

[16]Bermudez I, Hawkins C A, Taylor A M, et al. Actions of insecticides on the insect GABA receptor complex[J]. J Recept Res, 1991, 11: 221-232.

[17]Bown A W, Hall D E, MacGregor K B. Insect footsteps on leaves stimulate the accumulation of 4-aminobutyrate and can be visualized through increased chlorophyll fluorescence and superoxide production[J]. Plant Physiol, 2002, 129: 1430-1434.

[18]MacGregor K B, Shelp B J, Peiris S et al. Overexpression of glutamate decarboxylase in transgenic tobacco plants deters feeding by phytophagous insect larvae[J]. J Chem Ecol, 2003, 29: 2177-2182.

[19]Wang L, Wu J. The essential role of jasmonic acid in plant-herbivore interactions--using the wild tobacco Nicotiana attenuata as a model[J]. J Genet Genomics, 2013, 40: 597-606.

[20]Gaquerel E, Steppuhn A, Baldwin I T. Nicotiana attenuata alpha-DIOXYGENASE1 through its production of 2-hydroxylinolenic acid is required for intact plant defense expression against attack from Manduca sexta larvae[J]. New Phytol, 2012, 196: 574-585.

[21]Hettenhausen C, Baldwin I T, Wu J. Nicotiana attenuata MPK4 suppresses a novel jasmonic acid (JA) signaling-independent defense pathway against the specialist insect Manduca sexta, but is not required for the resistance to the generalist Spodoptera littoralis[J]. New Phytol, 2013,199: 787-799.

[22]Woldemariam M G, Dinh S T, Oh Y, et al. NaMYC2 transcription factor regulates a subset of plant defense responses in Nicotiana attenuata[J]. BMC Plant Biol, 2013, 13: 73.

[23]Wunsche H, Baldwin I T, Wu J. S-Nitrosoglutathione reductase (GSNOR) mediates the biosynthesis of jasmonic acid and ethylene induced by feeding of the insect herbivore Manduca sexta and is important for jasmonate-elicited responses in Nicotiana attenuata[J]. J Exp Bot, 2011, 62: 4605-4616.

[24]Yang D H, Hettenhausen C, Baldwin I T, et al. Silencing Nicotiana attenuata calcium-dependent protein kinases, CDPK4 and CDPK5, strongly up-regulates wound- and herbivory-induced jasmonic acid accumulations[J]. Plant Physiol, 2012, 159: 1591-1607.

[25]Ziegler J, Keinanen M, Baldwin I T. Herbivore-induced allene oxide synthase transcripts and jasmonic acid in Nicotiana attenuata[J]. Phytochemistry, 2001, 58: 729-738.

[26]Wu Y J, Wu Y J, Luo X, et al. Identification of differentially expressed genes that potentially confer pest resistance in transgenic ChIFN-gamma tobacco[J]. Gene, 2014, 543: 181-189.