Maillard 反應生成DDMP 的影響因素

徐華軍，陳良元，徐迎波，徐志強，李 魯，鄒 鵬，張李明，夏 虹

1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州市東風路5號 450001

2.安徽中煙工業有限責任公司技術中心，合肥市高新區天達路9號 230088

3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

自Mills［1］首次從Maillard 反應產物中鑒定出2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one,DDMP）以 來，人們從DDMP 的形成機理到DDMP 的生理學功能等多個方面開展了大量的研究工作［2-4］。DDMP 主要通過還原糖和氨基酸的Maillard 反應生成，形成于一些食品的常規烹飪、烘烤過程中［5-8］。單糖（己糖）脫水也有可能形成DDMP，但是產率較低［9］。研究發現，云南地區烤煙煙氣中的DDMP 顯著高于其他地區，與煙氣的甜味顯著正相關。雖然人們在DDMP 形成機理方面已經做了大量研究工作，但是這些研究主要通過液體介質進行，不能模擬卷煙燃燒過程。為此，采用干熱方法模擬卷煙抽吸過程，研究了氨基酸與葡萄糖/果糖在不同反應條件下對DDMP 生成量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

“黃山”牌卷煙產品G#（三類卷煙）和B#（二類卷煙）未加香配方煙絲（安徽中煙工業有限責任公司提供）。

D-葡萄糖、D-果糖、無水硫酸鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、天冬酰胺（Asn）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）（高純試劑，合肥博美生物科技有限責任公司）；乙酸苯乙酯（AR，百靈威化學技術有限公司）；食用乙醇（95%，安徽豐原集團）。

Agilent 6890N/5975 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；BSA2245-CW 電子分析天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius 公司）；DK 消解儀（意大利VELP公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDMP 的制備和分析

取一定量的氨基酸與D-葡萄糖或D-果糖按照不同摩爾比混合，在研缽中研磨混勻。將混合物轉移至具塞耐壓試管中，充入含有一定量氧氣的氮氣，密閉，置于DK 消解儀中，控制不同反應條件；反應完成后冷卻至室溫，加入1 g 無水硫酸鈉除去水分，加入20 mL 二氯甲烷超聲萃取15 min，過濾除去不溶物；加入200 μL 100 μg/mL 的乙酸苯乙酯內標，減壓濃縮至1 mL，進行GC/MS 色譜分析。分析條件［10-11］為：

色譜柱：H P-5MS 毛細管柱（30m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：240℃；載氣：H e；恒流模式：1.0mL/min；程序升溫：進樣量：1 μL；分流比：10:1；傳輸線溫度：280℃；電離方式：EI；電離能量：70eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：160℃；掃描范圍：50～450 amu；溶劑延遲：2min；檢測模式：S C A N。

所得圖譜經計算機譜庫（NIST05,Wiley275）檢索，并結合標準圖譜和有關文獻，確定DDMP 的結構。DDMP 的含量采用內標法定量。

1.2.2 DDMP 在卷煙中的應用

準確稱取適量DDMP 反應產物，加入10 mL 70%乙醇，攪拌溶解。用微量噴霧器均勻施加到黃山G#和B#兩個未加香配方煙絲上，將煙絲卷制成煙支，放入溫度（22±1）℃和濕度（60±2）%的恒溫恒濕箱內平衡48 h 以上，選擇15 名擁有國家煙草專賣局頒發的卷煙感官評吸技術合格證書的專業人員組成評價小組，按照GB 5606.4—2005［12］的方法分別從香氣質、香氣量、雜氣、刺激性和余味等方面對加香效果進行評價，對照樣煙為加入等量70%乙醇煙絲卷制成的卷煙。

2 結果及討論

2.1 影響卷煙燃燒過程中DDMP 生成量的因素

2.1.1 氨基酸種類

烤煙中含有多種游離氨基酸［13］，其中以脯氨酸和天冬酰胺的含量最高，其次是丙氨酸、酪氨酸以及蘇氨酸等。取1 mmol 的脯氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和酪氨酸，分別與D-葡萄糖或D-果糖按照摩爾比1∶1的比例混合，在10%氧氣的氮氣環境中，150 ℃反應10 min。DDMP 的生成量結果見表1。由表1 可知，5 種氨基酸中，酪氨酸與糖反應的DDMP 生成量都很低，這可能是由于酪氨酸分子中苯環阻止酪氨酸重排而造成的。丙氨酸與果糖反應的DDMP 生成量最高，脯氨酸次之。總體來說，D-果糖反應體系的DDMP 生成量高于D-葡萄糖反應體系，但是酪氨酸例外。同時酪氨酸、脯氨酸分別與D-果糖和D-葡萄糖反應的DDMP 生成量差別相對較小。由于在烤煙型煙葉中丙氨酸含量較低［13］，因此，選擇脯氨酸進行其他條件實驗。

表1 氨基酸種類對DDMP 生成量的影響

2.1.2 氧氣濃度

卷煙在抽吸過程中，燃燒區的氧氣含量從卷煙紙到燃燒區中心遞減，其平均氧氣含量約為9%［14］。實驗選取了氧氣含量分別為0,5%,10%,15%和20% 5 個濃度的氮氣環境模擬卷煙抽吸過程，單糖與脯氨酸摩爾比1:1，實驗溫度150 ℃，反應時間10 min，DDMP 生成量變化情況見圖1。由圖1 可知，氧氣濃度對D-葡萄糖-脯氨酸反應體系中DDMP 的生成量沒有顯著影響；而對D-果糖-脯氨酸反應體系的影響較大，隨著氧氣含量的增加，DDMP 的生成量顯著下降，并在氧氣含量為10%時下降到最低點。考慮到卷煙燃燒區平均氧氣濃度實際情況，選擇氧氣濃度為5%～15%進行正交實驗研究。

2.1.3 反應時間

圖1 氧氣濃度對DDMP 生成量的影響

不同的反應時間會影響到Maillard 反應的進程，進而影響DDMP 的生成量。在相同的物料比、反應溫度和反應環境條件下進行實驗，發現不同反應時間對DDMP 的生成量有顯著影響，結果如圖2。從圖2 可知，在反應2 min 時還沒有DDMP 生成，隨著反應時間的延長，DDMP 的生成量逐漸增加，其中D-葡萄糖在8 min，D-果糖在6 min 時，DDMP 的生成量達到最大值；而后，隨著反應時間的延長，DDMP 含量逐步下降，這可能是由于DDMP 逐步裂解成為其他香味成分所致［15］。

圖2 反應時間對DDMP 生成量的影響

2.1.4 反應溫度

圖3 是在其他反應條件固定的情況下，D-果糖、D-葡萄糖與脯氨酸在不同溫度下反應DDMP 的生成量結果。由圖3 可以看出，反應溫度對DDMP 生成量有顯著的影響。在100 ℃時，由于單糖不能熔化發生反應，DDMP 生成量極低；隨著溫度逐步上升，反應快速進行；在150 ℃時，DDMP 生成量達到最高。而當溫度上升到200 ℃以上時，由于高溫下，果糖/葡萄糖在進行Heyns或Amadori 重排前就已經分解為小分子化合物，這些小分子化合物隨后直接與氨基酸反應生成了類黑精等，造成兩種反應體系中DDMP 的含量均出現了比較明顯的下降；其中，葡萄糖-脯氨酸反應體系下降更為顯著，DDMP 的含量只有150 ℃時的30%左右。因此，選擇150 ℃為合成DDMP 適宜的反應溫度，這與文獻［16］報道的DDMP 主要在較低溫度條件下生成的結果基本一致。

2.1.5 物料摩爾比

圖3 反應溫度對DDMP 生成量的影響

圖4 為其他反應條件固定，葡萄糖/果糖與脯氨酸摩爾比分別為1:3,1:2,1:1,2:1 和3:1 時，DDMP 生成量變化情況。從圖4 可以看出，隨著單糖添加量的增加，DDMP 的生成量呈現逐步上升的趨勢，并且在摩爾比為2:1 時達到最高值；而后隨著單糖添加量的增加，DDMP的生成量又出現了下降。

總體來說，果糖反應體系的DDMP 生成量高于葡萄糖反應體系，并且物料摩爾比對果糖反應體系的影響要遠遠大于葡萄糖反應體系，特別是當果糖/脯氨酸摩爾比從1:1 上升到2:1 時，DDMP 生成 量急劇上升，物料摩爾比的影響極其顯著。

圖4 糖與脯氨酸摩爾比對DDMP 生成量的影響

2.2 正交實驗確定的最佳反應條件

前面的單因素實驗討論了各單因子的影響，由于在實際反應中，各個因子對反應存在交叉影響，因此，為了全面考察影響因素，以果糖-脯氨酸為反應體系，設計了4 因素3 水平的L9（34）正交實驗，因素水平和正交實驗結果見表2。

通過正交實驗和數據處理結果表明，影響Maillard反應生成DDMP 因素的主次順序為：A＞B＞D＞C，即氧氣濃度對DDMP 生成量影響最大，果糖與脯氨酸之間的摩爾比影響次之，反應溫度影響相對較小。最佳反應條件為：A1B2C2D2，即氧氣濃度5%，果糖與脯氨酸摩爾比2:1，反應時間7 min，反應溫度150 ℃。準確稱取2 mmol 果糖和1 mmol 脯氨酸，在正交優化實驗條件下平行實驗3 次，得到DDMP 的生成量分別為2736.28,2695.74 和2715.30 μg。反應得到 的DDMP 的平均生 成量為2715.77 μg。

表2 L9（34）正交實驗結果

2.3 應用效果評價

添加不同比例優化條件下DDMP 反應產物的卷煙樣品的評價結果見表3。由表3 可知，與對照卷煙相比，添加DDMP 卷煙的香氣質和香氣量增加，雜氣減少，同時刺激性降低，余味的干燥感和甜潤感有不同程度的改善。DDMP 在黃山卷煙中的用量為0.05%（質量比）時效果最好。

表3 加香卷煙評吸結果

3 結論

①不同氨基酸種類對DDMP 的形成起著非常顯著的影響，丙氨酸與果糖、脯氨酸與葡萄糖/果糖反應生成DDMP 的量較高。②在脯氨酸-果糖反應體系中，在氧氣濃度5%，果糖/脯氨酸摩爾比2:1，反應時間7 min，反應溫度150 ℃，DDMP 的生成量最高。③在配方煙絲中添加0.05%（質量比）DDMP 能夠增加卷煙香氣量，提高香氣質，并改善煙氣的味覺特征。

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