黃漿水中高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及鑒定

劉佳榮，梁金鐘

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

黃漿水中高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及鑒定

劉佳榮，梁金鐘*

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

經(jīng)初篩、復(fù)篩，從黃漿水中篩得一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定，并與GenBank上已提交的16S rDNA進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，其歸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。由MEGA 6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，該菌株與Lactobacillus plantarum 16S rDNA序列同源性達(dá)99%，且與生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此，確定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），編號(hào)為L(zhǎng)P-Dfa301，測(cè)得其發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量為5.833 g/L。

γ-氨基丁酸；乳酸菌；黃漿水；16S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA），又稱氨酪酸、4-氨基丁酸，分子式為C4H9O2N，相對(duì)分子質(zhì)量為103.12[1]。結(jié)構(gòu)式及三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 GABA的結(jié)構(gòu)式（a）及三維結(jié)構(gòu)（b）Fig.1 Formula (a) and three-dimensional structure (b) of GABA

GABA有多種生理功能，如：延緩大腦衰老、降低血壓[2]、降低血氨、治療神經(jīng)疾病[3]、抗心律失常、健肝利腎、預(yù)防肥胖、醒酒、改善更年期綜合征等[4]。已成為一種新型活性因子，廣泛用于醫(yī)藥與食品領(lǐng)域并成為研究熱點(diǎn)[5]。新型GABA抑制劑研究開(kāi)發(fā)的成功，以及其分子生物學(xué)方面的研究成果使GABA這一靶標(biāo)引起農(nóng)藥學(xué)家和昆蟲(chóng)毒理學(xué)家的重視[6]。而作為飼料添加劑可以顯著提高畜禽的生產(chǎn)能力。因此，加強(qiáng)GABA相關(guān)產(chǎn)品的安全性能及其副產(chǎn)品的研制開(kāi)發(fā)，將豐富飼料添加劑的種類，有益于畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[7]。

目前，制備GABA的方法主要有[8]：化學(xué)合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法3 種。化學(xué)法速度快、得率高，但成本高、安全性差；植物富集法含量很低，造價(jià)高且浪費(fèi)資源；與前兩者比較，生物法則具有成本低、發(fā)酵周期短、產(chǎn)率較高、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。微生物發(fā)酵法原以大腸桿菌作為合成GABA的菌株，但其存在安全衛(wèi)生方面的隱患[9]。利用大腸桿菌合成GABA是因?yàn)槠鋼碛泄劝彼崦擊让福╣lutamic acid decarboxylase，GAD）活性[10]。最新的一些研究報(bào)道[11-12]稱，天然乳酸菌的耐酸生長(zhǎng)機(jī)制可能與它們含有的GAD活力有關(guān)，啟示可以利用乳酸菌生物合成GABA。其微生物發(fā)酵原理[13-14]見(jiàn)圖2。

圖2 微生物發(fā)酵產(chǎn)GABA原理Fig.2 Microbial fermentation for GABA production

GAD是生物體催化谷氨酸（Glu）脫羧生成GABA的關(guān)鍵酶。乳酸菌中的乳球菌和乳桿菌均具有GAD[15]。目前，已有從酒糟中分離出短乳桿菌（Lactobacillus brevis）[16]、從酸菜中分離出嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）[17]和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[18]等的報(bào)道。

國(guó)內(nèi)許多學(xué)者都對(duì)產(chǎn)GABA的乳酸菌有所研究及篩選，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的姚子鵬等[19]對(duì)乳酸菌發(fā)酵黃漿水富集GABA有所研究，但未從黃漿水中篩選產(chǎn)GABA的菌株。隨著我國(guó)豆腐行業(yè)的發(fā)展，黃漿水的產(chǎn)量越來(lái)越高，因此，黃漿水的處理問(wèn)題日益受到關(guān)注。黃漿水中富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽[20]，適應(yīng)微生物生長(zhǎng)。從中篩選出產(chǎn)GABA的菌株，可以增加黃漿水的利用價(jià)值。而且國(guó)內(nèi)生物法生產(chǎn)GABA大部分進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液固定化生產(chǎn)，產(chǎn)率雖高，但其運(yùn)用的磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）等輔酶造價(jià)卻很高，且固定化步驟繁瑣不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在從黃漿水中篩選出一株高產(chǎn)GABA的菌株并對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定及構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)GABA，為今后大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)GABA的實(shí)現(xiàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水，取自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

硅膠板（GF254） 浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；γ-氨基丁酸 上海阿拉丁公司；冰乙酸 沈陽(yáng)市新西試劑廠；L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG） 黑龍江成褔食品有限公司；溶菌酶 北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Binding Buffer 科博賽爾科技發(fā)展有限公司；正丁醇 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Motic BA200顯微鏡 上海儀圓光學(xué)儀器廠；S-3400掃描電鏡 天美日立公司；BS 224S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LRH-生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；723N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；T100-PCR擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；SIM凝膠透成像系統(tǒng) 百維信生物生物科技有限公司；JY5000電泳儀 北京市君意機(jī)電技術(shù)公司。

1.3 培養(yǎng)基

乳酸菌分離培養(yǎng)基（BCP培養(yǎng)基）[18]：乳糖5.0 g/L、酵母粉5.0 g/L，溴甲酚紫溶液（質(zhì)量濃度5 g/100 mL水溶液）2.5 mL，pH 6.8～7.0。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20.0 g/L（121 ℃，滅菌15 min）。

菌種活化、保藏及分離培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、牛肉粉10.0 g/L、無(wú)水乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L，吐溫-80 1.0 mL，自然pH值。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20.0 g/L（121 ℃，滅菌15 min）。

發(fā)酵培養(yǎng)基（TYG培養(yǎng)基）：胰蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、丁二酸鈉5.0 g/L、L-MSG 10.0 g/L，自然pH值（105 ℃，滅菌20 min）。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離篩選

將購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的黃漿水充分搖勻后按2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)48 h，取1 mL菌液加入9 mL無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋。取0.1 mL適宜稀釋倍數(shù)的菌懸液涂布于固體BCP平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單個(gè)周?chē)l(fā)黃菌落于固體MRS平板上，反復(fù)3～4 次劃線，至菌落性狀穩(wěn)定后轉(zhuǎn)接到MRS試管斜面中保存[21]。

1.4.2 GABA的測(cè)定

1.4.2.1 GABA的定性測(cè)定

將斜面中的菌株接種到MRS中，37 ℃培養(yǎng)20 h，再按2%的接種量接種于TYG培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h。7 000 r/min離心10 min，取上清液點(diǎn)樣，采用改良薄層層析法進(jìn)行定性分析[22]。薄層層析展開(kāi)劑為：V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3（含4 g/L水合茚三酮），以1 g/L GABA做對(duì)照，距離硅膠板底邊緣1 cm點(diǎn)樣2 μL（直徑不超過(guò)4 mm），展開(kāi)劑中層析2 h，層析完畢自然干燥后90 ℃顯色10 min，比較Rf值。

1.4.2.2 GABA的定量測(cè)定

Berthelot改良比色法[23]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制質(zhì)量濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.4 mL不同質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入1 mol/L的Na2CO3溶液0.1 mL；0.2 mol/L pH 9.0的四硼酸鈉緩沖溶液0.5 mL；質(zhì)量濃度為6 g/100 mL的苯酚水溶液1 mL；含有10%有效氯的次氯酸鈉溶液1 mL，振蕩混勻，放置10 min。然后沸水浴10 min；最后冰浴20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇水溶液2 mL，振蕩混勻，放置30 min。在640 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，并做平行樣。最后以GABA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD640nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將復(fù)篩后的菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，將液體MRS培養(yǎng)基的種子液按2%的接種量接種于TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h，7 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，稀釋10～20 倍，取0.4 mL稀釋后的發(fā)酵液，根據(jù)1.4.2.2節(jié)中測(cè)定GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定GABA含量。同時(shí)取適量發(fā)酵液，送至農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱）進(jìn)行氨基酸分析及GABA產(chǎn)量測(cè)定。對(duì)比Berthelot比色法確定GABA產(chǎn)量。

1.4.3 菌株的鑒定

1.4.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其形態(tài)并做電鏡掃描。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定[24]。

1.4.3.2 野生菌株基因組的提取

吸取37 ℃條件下活化48 h的菌液1 mL，12 000 r/min離心2 min。棄上清液，加180 μL 2 mg/mL溶菌酶，再加20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，55 ℃保溫15 min。加10 μL 10% SDS，渦旋（反復(fù)倒置）5 s，再加200 μL Binding Buffer，渦旋5 s，70 ℃保溫10 min。加入95%乙醇200 μL，渦旋5 s。沉淀與絮狀沉淀加入吸附柱，12 000 r/min離心1 min，棄上清液。加漂洗液First Buffer 500 μL，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，重復(fù)洗滌。加漂洗液Second Buffer 500 μL，12 000 r/min離心1 min，棄上清液。將吸附柱放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒廢液，開(kāi)蓋，室溫放置10 min。將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附柱中間加100 μL 65 ℃ pH 8.5的TE Buffer洗脫液，室溫放置2～5 min，13 000 r/min離心2 min。

1.4.3.3 菌株16S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

使用細(xì)菌16S rDNA的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。

反應(yīng)體系：DNA模板10 μL，10×PCR緩沖液5 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL，dNTPmix 8 μL，Taq DNA聚合酶（Hifi）1 μL，ddH2O 67 μL，總反應(yīng)體積為100 μL（混勻后快速離心15 s，50 μL分裝）。

PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性5 min；95℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 155 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳[25]。

1.4.3.4 菌株16S rDNA序列比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI（網(wǎng)址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.）中經(jīng)BLAST后與GenBank庫(kù)中已有序列比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選及產(chǎn)GABA的性能鑒定

2.1.1 產(chǎn)GABA菌株的分離篩選（初篩）

通過(guò)溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）乳酸菌分離培養(yǎng)基選得1 400多株產(chǎn)乳酸的菌株，按1.4.2.2節(jié)所述方法檢測(cè)上清液中GABA的含量，將其中GABA產(chǎn)量較高的菌株保存于MRS斜面中留作復(fù)篩用。

2.1.2 TYG發(fā)酵液中GABA的定性及定量測(cè)定（復(fù)篩）

2.1.2.1 TYG發(fā)酵液中GABA的定性測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)離心后按1.4.2.1節(jié)所述的方法，進(jìn)行薄層層析，與GABA標(biāo)準(zhǔn)品比較Rf值，確定其產(chǎn)GABA的能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 薄層層析結(jié)果Fig.3 Result of thin layer chromatography

由圖3可知，編號(hào)為Dfa301、Dfa432、Dfa650具有與GABA標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的Rf值，可以斷定此3 株菌均具有產(chǎn)GABA能力，且層析斑點(diǎn)顏色較深、直徑較大，可以確定其產(chǎn)GABA能力也較高。隨后將這3 株菌株進(jìn)行GABA定量測(cè)定。

2.1.2.2 TYG發(fā)酵液中GABA的定量測(cè)定

按1.4.2.2節(jié)所述的方法，以GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD640nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。統(tǒng)計(jì)分析得回歸方程y=1.342 9x－0.007 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6。證明GABA質(zhì)量濃度在0～0.6 g/L的范圍內(nèi)與OD640nm值相關(guān)性較好。隨后按1.4.2.2節(jié)所述的方法進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果如表1所示。

表1 各菌株GABA產(chǎn)量Table1 Production of GABA from four isolates

由于Berthelot比色法易受游離氨基的干擾而不適宜測(cè)定復(fù)雜培養(yǎng)基中GABA的含量[23]，所以將產(chǎn)量最高的編號(hào)為Dfa301的菌株送至農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱）進(jìn)行氨基酸分析及GABA產(chǎn)量測(cè)定（圖4），與Berthelot比色法進(jìn)行對(duì)比。

圖4 氨基酸自動(dòng)分析儀圖譜Fig.4 Profile obtained with automatic amino acid analyzer

由圖4可知，根據(jù)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》[27]國(guó)標(biāo)所列舉的方法利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定TYG發(fā)酵液中游離氨基酸總量?jī)H占0.172%；保留時(shí)間為8.72 min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)特征峰為谷氨酸，其殘留量為4.167 g/L；保留時(shí)間為21.75 min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)特征峰為GABA，其產(chǎn)量為5.833 g/L。與Berthelot比色法比較誤差較小，因此，將編號(hào)為Dfa301作為最終實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)其進(jìn)行鑒定，其TYG發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量為5.833 g/L。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

2.2.1 菌株的菌落形態(tài)

圖5 菌落形態(tài)特征Fig.5 Colonies of strain Dfa301

由圖5可知，肉眼觀察MRS平板上Dfa301的菌落形態(tài)呈不規(guī)則圓形，初期呈乳白色，直徑在1 mm左右，邊緣有透明狀，表面微微隆起。菌落易于挑取，在液體培養(yǎng)基中呈混濁狀態(tài)，為兼性厭氧型細(xì)菌。

2.2.2 菌株的細(xì)胞形態(tài)

利用光學(xué)顯微鏡觀察菌株Dfa301為短桿狀細(xì)菌單個(gè)或成對(duì)排列；不運(yùn)動(dòng)，無(wú)鞭毛；不產(chǎn)芽孢。經(jīng)革蘭氏染色確定其為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），見(jiàn)圖6a。再經(jīng)掃描電鏡，在放大倍數(shù)為7 000 倍條件下觀察，可以清楚的看到Dfa301菌體形態(tài)呈短桿狀，長(zhǎng)6.4～15.5 μm，寬2.0～4.1 μm（圖6b）。

圖6 Dfa301菌株革蘭氏染色形態(tài)特征（a）及其電鏡照片（b）Fig.6 Morphology (a) and electron micrograph (b) of strain Dfa301 after Gram staining

2.2.3 菌株Dfa301的生理生化鑒定

表2 菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Physiological and biochemical properties of strain Dfa301

由表2可知，將菌株Dfa301于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃活化20 h后，分別接入相應(yīng)培養(yǎng)基中觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)中初期（12～24 h）菌株可以使牛奶凝固，產(chǎn)酸后改變石蕊pH值，使其由藍(lán)紫色變?yōu)榧t色，48 h后乳清析出，結(jié)果呈陽(yáng)性；吲哚實(shí)驗(yàn)中乙醚與培養(yǎng)物之間未出現(xiàn)紅色環(huán)狀物，結(jié)果呈陰性；接觸酶實(shí)驗(yàn)中在載玻片上的活菌中滴加體積分?jǐn)?shù)為3% H2O2溶液未產(chǎn)生氣泡，結(jié)果呈陰性；檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基未發(fā)生顏色變化，因此不能利用檸檬酸鹽產(chǎn)酸，結(jié)果呈陰性；明膠液化實(shí)驗(yàn)中不能使明膠液化，結(jié)果呈陰性；硫化氫實(shí)驗(yàn)中試管壁上的乙酸鉛試紙未變黑，結(jié)果呈陰性。將菌株Dfa301劃線于MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落接入糖發(fā)酵管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象見(jiàn)表3。

表3 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Table3 Sugar fermentation tests

由表3可知，菌株Dfa301不能利用棉子糖、松三糖、鼠李糖產(chǎn)酸，結(jié)果呈陰性；其他糖呈陽(yáng)性。能利用葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸，但不能產(chǎn)氣；能在25 ℃條件下生長(zhǎng)，不能在45 ℃條件下生長(zhǎng)；能在pH 4.5條件下生長(zhǎng)，不能在pH 9.0條件下生長(zhǎng)，由此對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，可以初步確定菌株Dfa301為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.2.4 16S rDNA序列比對(duì)分析及分子生物學(xué)鑒定

2.2.4.1 菌株Dfa301基因組的提取及其16S rDNA的擴(kuò)增

按1.4.3.2節(jié)的方法提取菌株Dfa301的基因組，并以此為模板，采用通用引物擴(kuò)增16S rDNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖7所示。

圖7 菌株Dfa301的16S rDNA的擴(kuò)增譜帶Fig.7 Amplified 16S rDNA bands from strain Dfa301

由圖7可知，Dfa301菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)1條亮帶，其大小為分子質(zhì)量1 500 bp左右。

2.2.4.2 16S rDNA序列比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

測(cè)序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，得到菌株Dfa301的16S rDNA序列，用BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，與已公布序列同源性均達(dá)99%，隨機(jī)選取其中20 株細(xì)菌用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，如圖8所示。

圖8 菌株Dfa301的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of Dfa301

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖8）可知，野生細(xì)菌Dfa301與已報(bào)道的Lactobacillus plantarum親緣性一致，比對(duì)同源性均為99%，參照生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將Dfa301菌株定名為L(zhǎng)actobacillus plantarum Dfa301，簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)P-Dfa301。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從黃漿水中篩選出1 400多株菌株，經(jīng)過(guò)復(fù)篩篩選出3 株高產(chǎn)GABA的菌株。將其中一株產(chǎn)量最高（5.833 g/L，編號(hào)LP-Dfa301）的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定并與GenBank上已提交的16S rDNA進(jìn)行BLAST比對(duì)，表明其歸屬于乳酸桿菌（Lactobacillus）屬。由MEGA 6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明,菌株與Lactobacillus plantarum 16S rDNA序列同源性達(dá)99%，且與生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此，確定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。從黃漿水中篩選出產(chǎn)GABA的乳酸菌株，為富含GABA食品級(jí)添加劑的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，今后可在誘變育種、發(fā)酵工藝優(yōu)化及基因技術(shù)等方面著手研究，提高菌株的GABA產(chǎn)量。還可以利用該菌株發(fā)酵黃漿水產(chǎn)GABA，以提高黃漿水的利用價(jià)值，避免資源浪費(fèi)。

[1] 葉硯. 高產(chǎn)γ-氨基丁酸紅曲菌種培育及深層發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)研究[D].金華: 浙江師范大學(xué), 2010: 1-2.

[2] 王建峰, 任舉. γ-氨基丁酸的生理作用與制備方法綜述[J]. 山東化工, 2013, 42(2): 251-252.

[3] BENARROCH E E. Pedunculopontine nucleus functional organization and clinical implication[J]. Neurology, 2013, 80(12): 1148-1155.

[4] PARK K B, OH S H. Production of yogurt with enhanced levels of γ-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract[J]. Bioresource Technology, 2007, 9(8): 1675-1679.

[5] PARK K B, OH S H. Production and characterization of GABA rice yogurt[J]. Journal of Food Sick Biotechnology, 2005, 10: 434.

[6] YOSIPOVITCH G, BERNHARD J D. Clinical practice. Chronic pruritus[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 368(17): 1625-1634.

[7] 李靜, 李霞. γ-氨基丁酸在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用[J]. 中國(guó)飼料, 2010(3): 5.

[8] 黃桂東, 毛健, 姬中偉, 等. 一株產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌MJ0301培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(17): 165-166.

[9] 徐冬云, 周立平, 童振宇, 等. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的分離及篩選[J].中國(guó)食品添加劑, 2006(2): 105-109.

[10] KOMATSUZAKI N, SHIMA J, KAWAMOTO S. Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods[J]. Food Microbiology, 2005, 22(2): 497-504.

[11] LORCA G L, DEVALDEZ G F. A low-pH-inducible.stationary-phase acid tolerance pesponse in Lactobacillus acidophilus CRL639[J]. Current Microbiology, 2001, 42(1): 21-25.

[12] COTTER P D, GAHAN G M, HILL C. A glutamate decarboxylase system protects Listerria monocytogenes in gastric fluid[J]. Molecular Microbiology, 2001, 40(2): 465-475.

[13] 林親錄, 王婧, 陳海軍. γ-氨基丁酸的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(5): 496-498.

[14] 林謙. γ-氨基丁酸的生理功能概述[J]. 玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 31(2): 62-64.

[15] COTTER P D, HILL C. Surviving the acid test: responses of grampositive bacteria to low pH[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67(3): 429-453.

[16] YOKOYAMA S, HIRAMATSU J I, HAYAKAWA K. Production of γ-aminobutyric acid from alcohol distillery lees by Lactobacillus brevis IFO-12005[J]. Journal of Biomaterials Science Bioengin, 2002, 93(1): 95-97.

[17] 蔣冬花, 后加衡, 黃大年, 等. 酸菜中高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選[J].微生物學(xué)雜志, 2007, 27(1): 35-39.

[18] 韓雪, 梁金鐘. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的分離鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(22): 180-183.

[19] 姚子鵬, 吳非. 乳酸菌發(fā)酵黃漿水富集GABA的研究[J]. 食品科技, 2013, 38(4): 7-10.

[20] 李燕, 宋俊梅, 曲靜然. 豆制品廢水的處理及綜合利用[J]. 食品工業(yè)科技, 2002, 23(7): 70-72.

[21] 梁金鐘, 李雯, 王風(fēng)青. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及誘變育種[J].食品科學(xué), 2013, 34(23): 228-230.

[22] 陸小雪. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌分離與發(fā)酵條件優(yōu)化及飲料開(kāi)發(fā)[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008: 18-20.

[23] 趙宏飛, 宋偉, 裴家偉, 等. 食品中三種γ-氨基丁酸檢測(cè)方法比較[J].中國(guó)乳品工業(yè), 2008, 36(11): 52; 54.

[24] 布坎南R E, 吉布斯 N E. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組, 譯. 8版. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 809-821.

[25] 魏群. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)綜合大實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007: 8-15.

[26] 張麗娜, 榮昌鶴, 何遠(yuǎn), 等. 常用系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建算法和軟件鳥(niǎo)瞰[J].動(dòng)物學(xué)研究, 2013, 34(6): 640-650.

[27] GB/T 5009.124—2003 食品中氨基酸的測(cè)定[S].

Screening of Lactic Acid Bacteria with High Yield of Gamma-Aminobutyric Acid from Yellow Serofluid, the Wastewater from Tofu Production

LIU Jia-rong, LIANG Jin-zhong*
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

After primary screening and rescreening, a high-yield strain producing γ-aminobutyric acid (GABA) was isolated from yellow serofluid, the wastewater from tofu production. Morphology analysis, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequences in GenBank indicated that the strain belonged to the Lactobacillus genus. Then, the phylogenic tree generated by MEGA 6.0 software revealed that it was closely related to Lactobacillus plantarum with a similarity of 99%, and numbered LP-Dfa301. In the fermentation broth, GABA production could reach 5.833 g/L.

γ-aminobutyric acid (GABA); Lactobacillus; yellow serofluid; 16S rDNA; phylogenic tree

Q939.97

A

1002-6630（2014）23-0221-05

10.7506/spkx1002-6630-201423043

2014-06-22

黑龍江省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2010td04）

劉佳榮（1989—），女，碩士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)與發(fā)酵工程。E-mail：183650482@qq.com

*通信作者：梁金鐘（1957—），男，教授，本科，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)與發(fā)酵工程。E-mail：Ljz2050@126.com