脯氨酰羥化酶3調控低氧誘導因子1α表達在非小細胞肺癌中的臨床意義研究

潘 坤，張 惠，張澤明，李 崢，楊 衛，陳 曄

低氧誘導因子1α(HIF-1α)是哺乳動物適應低氧環境的關鍵轉錄調節因子，參與了腫瘤的生長繁殖、遠處轉移、血管生成、細胞凋亡等[1]。HIF-1α蛋白降解的關鍵步驟是脯氨酰殘基的羥基化，催化此過程的脯氨酰羥化酶(PHD)是整個過程的限速酶[2]。目前發現PHD有4種(PHD1、PHD2、PHD3、PHD4)，低氧情況下，PHD3發揮主要調節作用，是否可通過上調PHD3的表達，從而降低腫瘤組織中HIF-1α的表達水平及活性，并進一步抑制腫瘤的侵襲、遠處轉移，值得深入研究。本研究旨在通過研究非小細胞肺癌患者腫瘤組織及癌旁正常肺組織中的PHD3表達情況，及其與HIF-1α蛋白表達和非小細胞肺癌患者腫瘤淋巴結轉移、臨床分期等生物學特性的關系，為臨床腫瘤的防治探索新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料收集 收集河北大學附屬醫院2010年7月—2012年4月手術切除的非小細胞肺癌標本89例，取非小細胞肺癌組織、癌旁正常肺組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)標本進行實驗。所有患者經病理確診，術前未行化療、放療、介入及中藥等抗腫瘤治療，均有完整的病例資料且知情同意。其中男54例，女35例；確診時年齡37～64歲，中位年齡58歲；淋巴結轉移51例(淋巴結轉移組)，無淋巴結轉移38例(無淋巴結轉移組)；腫瘤分期(TNM)：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。臨床分期標準按照第7版美國聯合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯盟(UICC)制訂的TNM分期標準分類。免疫印跡法(Western blotting)檢測所用的腫瘤肺組織及癌旁正常肺組織切除后立即置于-70 ℃冰凍保存。

1.2 研究方法 反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)：擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，嚴格按照該公司TRIZOL試劑使用說明書進行試驗，提取總RNΑ，反轉錄后行PCR；應用瓊脂糖凝膠電泳，對擴增產物條帶行吸光度半定量分析。反應循環參數如下：(1)HIF-1α，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s(共32個循環)，72 ℃延伸10 min。(2)PHD3，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s(共30個循環)，72 ℃延伸10 min。各檢測指標及內參照物(β-actin)的引物序列分別為：(1)HIF-1α(433 bp)上游：5′-GCCCCTACTATGTCGCTTTC-3′，下游：5′-GGCCCAAACTAAACTATCTGA-3′；(2)PHD3(337 bp)上游：5′-CCTGATGACATTATCGCCTCT-3′，下游：5′-AGCCTAGCGGTATGCGA-3′；(3)β-actin(635 bp)上游：5′-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3′，下游：5′- CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′。

Western blotting：0.1 g肺組織剪碎加入RIPA裂解液后冰浴勻漿，4 ℃ 10 000×g離心，去除沉淀后得到肺組織總蛋白，蛋白樣品稀釋至相同濃度分裝，放置于-80 ℃冷凍保存。實驗時使用微量進樣器將等量蛋白質樣品加至7.5%SDS-丙烯酰胺凝膠孔中，應用200 V電壓電泳，轉印到硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)保溫過夜，TBST緩沖液沖洗后加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，充分漂洗后化學發光試劑盒膠片曝光，對擴增產物條帶吸光度行半定量分析。

1.3 結果評定 上海Tanon Gis—2010圖像分析系統對Western blotting、RT-PCR產物條帶行半定量分析，計算目的條帶與β-actin的吸光度比值作為相對表達量。

2 結果

2.1 PHD3 mRNA和蛋白在非小細胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達 RT-PCR結果顯示，PHD3 mRNA在非小細胞肺癌組織中的相對表達量為(17.8±2.9)，高于癌旁正常肺組織中的(7.1±1.3)，差異有統計學意義(t=31.763，P<0.05，見圖1)。 Western blotting結果顯示，PHD3蛋白在非小細胞肺癌組織中的相對表達量為(13.0±2.8)，低于癌旁正常肺組織中的(20.7±4.2)，差異有統計學意義(t=14.391，P<0.05，見圖2)。癌旁正常肺組織及非小細胞肺癌組織不同臨床分期PHD3 mRNA及蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著TNM分期的增加，PHD3 mRNA的相對表達量增高，而PHD3蛋白的相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。癌旁正常肺組織及有無淋巴結轉移組PHD3 mRNA及蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；且淋巴結轉移組PHD3 mRNA的相對表達量高于癌旁正常肺組織和無淋巴結轉移組，PHD3蛋白的相對表達量低于癌旁正常肺組織和無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.2 HIF-1α mRNA和蛋白在非小細胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達 RT-PCR結果顯示，HIF-1α mRNA在非小細胞肺癌組織中的相對表達量為(17.2±2.9)，高于癌旁正常肺組織中的(6.5±1.2)，差異有統計學意義(t=32.163,P<0.05，見圖1)。Western blotting結果顯示，HIF-1α蛋白在非小細胞肺癌組織中的相對表達量為(20.9±3.8)，高于癌旁正常肺組織的(9.2±1.8)，差異有統計學意義(t=26.251，P<0.05，見圖2)。癌旁正常肺組織及非小細胞肺癌組織不同臨床分期HIF-1α的mRNA及蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著TNM分期的增加，HIF-1α mRNA及蛋白的相對表達量增高，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。癌旁正常肺組織及有無淋巴結轉移組HIF-1α mRNA及蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；且淋巴結轉移組HIF-1α mRNA及蛋白的相對表達量高于癌旁正常肺組織和無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 非小細胞肺癌組織中PHD3 mRNA和蛋白表達與HIF-1α蛋白表達的相關性 非小細胞肺癌組織PHD3蛋白的表達與HIF-1α蛋白的表達呈負相關(r=-0.746，P<0.05)；PHD3 mRNA的表達與HIF-1α蛋白表達呈正相關(r=0.792，P<0.05)。

注：C為癌旁正常肺組織，T為非小細胞肺癌組織；PHD3=脯氨酰羥化酶3，HIF-1α=低氧誘導因子1α
圖1 RT-PCR檢測PHD3、HIF-1α的mRNA表達水平
Figure1 RT-PCR analysis of PHD3 and HIF-1α mRNA levels

注：C為癌旁正常肺組織，T為非小細胞肺癌組織
圖2 Western blotting檢測PHD3、HIF-1α的蛋白表達水平
Figure2 Western blotting analysis of PHD3 and HIF-1α protein levels

表1 癌旁正常肺組織及非小細胞肺癌組織不同臨床分期PHD3和HIF-1α的mRNA及蛋白表達比較Table 1 Comparison of PHD3，HIF-1α mRNA and protein levels in different clinical stages of lung tissues and adjacent normal lung tissues

注：與癌旁正常肺組織比較，*P<0.05；與非小細胞肺癌Ⅰ期比較，△P<0.05；與非小細胞肺癌Ⅱ期比較，☆P<0.05；PHD3=脯氨酰羥化酶3，HIF-1α=低氧誘導因子1α

表2 癌旁正常肺組織及有無淋巴結轉移組PHD3和HIF-1α的mRNA及蛋白表達的比較Table 2 Comparison of PHD3，HIF-1α mRNA and protein levels in different groups of lymph node metastasis and adjacent normal lung tissues

注：與癌旁正常肺組織比較，*P<0.05；與無淋巴結轉移組比較，△P<0.05

3 討論

腫瘤發生發展過程中的一個典型特征是腫瘤內部組織的局部低氧，HIF-1α是調控組織細胞適應低氧環境的關鍵轉錄因子。正常氧壓情況下，HIF-1α可通過腫瘤抑制蛋白pVHL介導的泛素蛋白酶體途徑迅速降解；低氧情況下，因HIF-1α羥基化過程受阻，胞質內HIF-1α積聚增多并轉移入核，與HIF-1β結合形成HIF-1異二聚體，進而調節多種與細胞代謝和新生血管生成有關的蛋白表達并促進腫瘤的侵襲和轉移。因此，HIF-1α在腫瘤的惡性發展過程中起著關鍵作用。HIF-1α降解的關鍵是PHD催化HIF-1α脯氨酰殘基羥基化，而催化此過程的PHD便是全過程的限速酶[3]。國內關于PHD蛋白表達與HIF-1α調控的研究主要集中在體外細胞中進行，在人類非小細胞肺癌組織中是否也存在相應的調控機制目前還不明確。本研究通過對比分析89例非小細胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的PHD3和HIF-1α表達的差異，闡明PHD3調控HIF-1α表達與非小細胞肺癌患者生物學特性的關系，為腫瘤防治新思路提供理論依據。

本研究發現，PHD3 mRNA在非小細胞肺癌組織中的表達高于癌旁正常肺組織，Western blotting結果顯示PHD3蛋白變化趨勢與其mRNA的變化趨勢相反，即PHD3蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達低于癌旁正常肺組織。有研究表明低氧可以誘導PHD3 mRNA的表達[4]，體外細胞實驗發現，低氧情況下HIF-1α可增加對PHD3 mRNA的轉錄激活，應用siRNA抑制HIF-1α的表達可導致低氧誘導的PHD3表達減少，因此HIF-1α蛋白的表達在非小細胞肺癌組織高于癌旁正常肺組織，這可能是導致PHD3 mRNA表達增高的原因。本研究還發現，PHD3 mRNA和蛋白的變化趨勢不相符，非小細胞肺癌組織中PHD3 mRNA的表達是升高的，而其蛋白的表達水平呈下降趨勢，提示非小細胞肺癌組織中PHD3的表達可能受某種蛋白水平的調控，但其具體分子機制仍有待于進一步研究。有研究結果表明，PHD可能是一種抑癌基因，Su等[5]研究了PHD2在胰腺癌組織中的表達，發現有淋巴結轉移組的PHD2表達要低于無淋巴結轉移組，同期的大鼠實驗發現，PHD2過表達可導致腫瘤生長遲緩并抑制腫瘤的轉移。Xue等[6]發現，PHD3蛋白在結直腸癌組織中表達水平下降，并且與腫瘤的分化程度及是否伴隨淋巴結轉移密切相關，抑制PHD3表達可以明顯促進腫瘤細胞的生長和成瘤性。亦有臨床研究通過檢測大樣本乳腺癌患者，發現>50%的乳腺癌患者乳腺組織中至少有一種PHD表達，從側面提示了PHD作為抑癌基因存在的可能[7]。本研究中PHD3蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達低于癌旁正常肺組織，同時PHD3蛋白的表達在腫瘤不同病理分期各組間亦有差異，淋巴結轉移組PHD3蛋白表達低于癌旁正常肺組織和無淋巴結轉移組，上述結果均提示PHD3可能作為一種抑癌基因存在，具有抑制腫瘤發生發展的潛能。

本研究結果還顯示，HIF-1α在癌旁正常肺組織中有一定表達，提示即使在正常情況下HIF-1α對目標基因的調節作用也是存在的，雖然在正常氧壓情況下HIF-1α的表達相對較少，但對于生物體的正常細胞代謝和信號轉導還是非常重要的。本研究中非小細胞肺癌患者腫瘤組織HIF-1α mRNA和蛋白表達均升高，提示其轉錄水平和翻譯水平均上調。上調的HIF-1α表達一方面可能與腫瘤內部組織低氧導致PHD3活性下降有關，另一方面可能與PHD3的表達相對減少從而抑制了HIF-1α經泛素蛋白酶體途徑降解有關。HIF-1α在腫瘤血管形成、腫瘤干細胞分化中發揮著重要作用，目前研究者在大部分腫瘤組織中均發現HIF-1α的廣泛存在。迄今為止已有多位學者證實，在如胃癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中均發現HIF-1α蛋白的高表達，同時其表達水平與腫瘤的病理分期、遠處侵襲等密切相關[8-10]，Karetsi等[11]通過免疫組化試驗亦發現，在非小細胞肺癌患者腫瘤組織中HIF-1α大量表達。Song等[12]發現在腫瘤細胞中，應用漢黃芩素降低HIF-1α的表達后，可進而導致其下游靶基因血管內皮生長因子(VEGF)的表達減少，從而抑制腫瘤組織的血管生成。因此，設法降低HIF-1α的表達對于延緩腫瘤生長、解決化療藥物耐藥性等均有重要意義。

本研究的相關性分析表明，PHD3蛋白與HIF-1α蛋白的表達呈負相關，同時PHD3 mRNA與HIF-1α蛋白的表達呈正相關。由此可推測，在非小細胞肺癌組織內部的低氧微環境中，PHD3活性降低，同時其蛋白表達水平亦下降，導致HIF-1α在組織細胞中蓄積，增高的HIF-1α反過來激活PHD3的轉錄，使PHD3 mRNA表達增加，與之前在大鼠實驗中得出的結論相一致[13]。PHD3是調節HIF-1α表達和活性的關鍵物質，siRNA抑制PHD3的表達，低氧誘導的HIF-1α表達明顯增高，過表達PHD3則可抑制低氧誘導的HIF-1α表達。

綜上所述，PHD3調控HIF-1α表達可能在非小細胞肺癌的發病中發揮了重要作用，能否通過恰當途徑上調腫瘤組織中PHD3的表達進而增加HIF-1α降解成為腫瘤治療新的作用靶點。

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