運用綠色熒光蛋白探討肉葡萄球菌雙精氨酸分泌途徑

高 強，許保銀，程逸冰，王 林，張朝正，田萍萍

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 天津科技大學計算機科學與信息工程學院，天津 300222)

運用綠色熒光蛋白探討肉葡萄球菌雙精氨酸分泌途徑

高 強1，許保銀1，程逸冰1，王 林2，張朝正1，田萍萍1

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 天津科技大學計算機科學與信息工程學院，天津 300222)

根據肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300的基因組序列設計引物，經PCR擴增得到其tufA基因的啟動子Peftu片段與大腸桿菌–葡萄球菌穿梭載體pBT2-Tat-GFP連接，構建了穿梭質粒pBT2-ETG．結果表明，穿梭質粒pBT2-ETG成功地轉入大腸桿菌與肉葡萄球菌宿主中穩定表達具有活性的綠色熒光蛋白GFP，并被轉運到肉葡萄球菌宿主的細胞壁，為進一步研究肉葡萄球菌雙精氨酸(Tat)轉運系統正確分泌其他外源蛋白奠定了實驗基礎．

肉葡萄球菌；綠色熒光蛋白(GFP)；雙精氨酸轉運途徑；啟動子Peftu；Tat信號肽

作為肉制品發酵行業中形成肉制品風味的關鍵菌種，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)在歐洲等地被用作發酵肉產品起始培養物已經超過60年[1].與其他葡萄球菌相比，它不產生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是葡萄球菌屬中被完全確認的食品級GRAS(generally regarded as safe)菌株[2]．肉葡萄球菌具有很低的胞外蛋白水解能力，所以該菌可以作為基因克隆宿主菌[3]用于分子遺傳學方面進行葡萄球菌屬相關代謝途徑的研究，以及安全正常地表達和分泌異源蛋白．

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白，1962年由Shimomura等[4]在多管水母中首次發現．GFP受到紫外或藍光激發時可發射出綠色熒光，發色團是自身分子內由3個氨基酸殘基(甘氨酸、酪氨酸和蘇氨酸)所組成的，其綠色熒光的產生無需底物或輔因子，并且持續時間較長[5]．

根據信號肽的結構，可將其分為分泌型(Sec)信號肽、雙精氨酸轉運(twin-arginine transolcation，Tat)信號肽和脂蛋白(Lip)信號肽等[6]．目前對Sec

系統的研究已相當完善，Sec轉運系統只能轉運未折疊或部分折疊的蛋白質[7]，而Tat轉運系統可將處于正確折疊狀態的蛋白質轉運到細胞外，在基因工程領域中可以用于分泌無法通過Sec系統轉運的外源蛋白[8]．GFP作為一種理想的報告蛋白，可以在S.,carnosus內表達[9]，但能否被正確地折疊和跨膜轉運將取決于所選用的Tat信號肽序列[10–12]．

穿梭載體是能在2種不同的生物中復制的載體，通常用于克隆已擴增的基因[13]．目前，用于肉葡萄球菌宿主表達外源蛋白的質粒載體基本上都是非穿梭質粒，DNA連接產物直接轉化肉葡萄球菌的效率低，轉化較困難，而大腸桿菌–葡萄球菌的穿梭質粒，如pBT2載體[14]，就很好地解決了這個問題．因此，本實驗以穿梭載體pBT2為骨架，通過導入強啟動子，構建高效表達外源GFP的穿梭載體，探究雙精氨酸分泌信號肽在肉葡萄球菌中對GFP的轉運效果，從而為深入理解肉葡萄球菌中雙精氨酸信號肽分泌機理及研究其他外源蛋白在肉葡萄球菌中的表達奠定實驗基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α 由天津市工業微生物重點實驗室保藏(保藏號TCCC 11800)；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300菌株由德國圖賓根大學微生物遺傳學研究所的Goetz教授[3]饋贈．pMD19-T Simple Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌?葡萄球菌穿梭質粒pBT2-Tat-GFP由本實驗室以pBT2質粒為骨架構建得到，其中的Tat信號肽來源于肉葡萄球菌的鐵依賴型過氧化物酶(FepB)[11]．

1.1.2 酶與試劑

Taq DNA聚合酶、1,kbp DNA Ladder和DNA MarkerⅢ購于天根生化科技(北京)有限公司；T4,DNA Ligase、限制性內切酶Kpn I、Bam HI和低分子質量蛋白質Marker購自Fermentas中國公司．PCR引物合成及DNA測序工作委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成；質粒DNA的提取、DNA片段膠回收與產物純化采用購自天津寶瑞生物技術有限公司的GeneBond系列試劑盒．其他試劑和藥品為進口分析純或生化級試劑．1.1.3 培養基和培養條件

大腸桿菌和肉葡萄球菌的培養均使用LB培養基(胰蛋白胨10,g/L，酵母浸提物5,g/L，NaCl 10,g/L，固體培養基含瓊脂20,g/L)．對于重組菌株的篩選，氨芐青霉素終質量濃度為100,μg/mL，氯霉素終質量濃度為10,μg/mL．肉葡萄球菌感受態細胞的培養使用B2培養基(酪蛋白10,g/L，酵母浸提物25,g/L，葡萄糖5,g/L，NaCl 25,g/L，K2HPO41,g/L)．電轉化孵育使用TSB培養基(胰蛋白胨17,g/L，大豆蛋白胨3,g/L，葡萄糖2.5,g/L，NaCl 5,g/L，K2HPO42.5,g/L)[15]．大腸桿菌和肉葡萄球菌的振蕩培養條件均為37,℃、180,r/min.

1.2 方法

1.2.1 啟動子Peftu的擴增

編碼EF-Tu(延伸因子)的tuf基因廣泛存在于原核生物中，其主要生物功能是在蛋白質合成過程中負責肽鏈的延伸，而且tuf基因的啟動子屬于強啟動子，因此根據S.,carnosusTM300基因組中tufA基因(GenBank ID：7551602)的啟動子Peftu序列，設計出1對引物eftu1和eftu2，用于擴增啟動子Peftu片段. eftu1：5′-GGGTACC TTTTTTGGTAGGGTTCCT GAATT-3′(Kpn I)；eftu2：5′-CGGATCC TATGAAAT CTCTCCTCTTCTTAATAAAA AG-3′(Bam HI)

使用玻璃微珠法[16]提取的肉葡萄球菌基因組為模板，利用引物eftu1和eftu2以PCR法擴增啟動子Peftu．擴增采用50,μL體系：ddH2O 17.5,μL，模板2.5,μL，eftu1 2.5,μL，eftu2 2.5,μL，2×Taq PCR MasterMix聚合酶25,μL．擴增程序為：95,℃ 10,min，94,℃,30,s，62.8,℃ 30,s，72,℃ 30,s，30個循環，72,℃10,min．瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，并對產物進行切膠回收．

1.2.2 pBT2-ETG載體的構建

啟動子Peftu的PCR擴增產物與質粒pMD19-T Simple Vector通過T4 Ligase于16,℃過夜連接后，使用化學轉化法轉化進入E.,coli DH5α ，提取大腸桿菌轉化子質粒，對其進行Kpn I/Bam HI雙酶切驗證及PCR驗證．挑取攜帶有重組質粒的陽性轉化子E.,coli DH5α 單菌落接種在含Amp的LB培養液中，37,℃、180,r/min過夜培養，培養物送至北京六合華大基因科技股份公司進行測序．

使用Kpn I/Bam HI對質粒pBT2-Tat-GFP進行雙酶切，用DNA片段純化回收試劑盒純化回收相應的酶切產物，與測序正確并經相同雙酶切的PCR產物通過T4,Ligase于16,℃進行過夜連接，連接產物使

用化學轉化法轉化進入E.,coli DH5α 宿主細胞中，提取大腸桿菌轉化子質粒，對其進行Kpn I/Bam HI雙酶切驗證及PCR驗證，并將該質粒命名為pBT2-ETG，其圖譜見圖1．

1.2.3 肉葡萄球菌的電轉化

參照Gao等[17]改進的方法將連接產物電轉化進入肉葡萄球菌，并對轉化子質粒進行雙酶切和PCR驗證．

1.2.4 GFP的表達

分別接種陽性重組菌株S.,carnosusTM300/pBT2-ETG、S.,carnosusTM300/pBT2-Tat-GFP、E. coli/pBT2-ETG、E.,coli/pBT2-Tat-GFP，陰性對照菌株S.,carnosusTM300、E.,coli DH5α 于5,mL LB培養液中，37,℃、180,r/min過夜培養；轉接0.5,mL過夜培養物于50,mL LB培養液中，37,℃、180,r/min繼續培養16,h，以表達GFP．

1.2.5 表達產物GFP的檢測

熒光顯微鏡觀察：各取10,μL按1.2.4方法培養的菌液，滴在載玻片表面并蓋好蓋玻片后，置于熒光顯微鏡下觀察各菌液的熒光產生情況．

SDS-PAGE與Native-PAGE分析：參考Meissner等[10]的方法，分別提取陽性重組菌株與陰性對照菌株的細胞壁和原生質體中蛋白組分，以發酵液為對照，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠進行SDSPAGE與Native-PAGE檢測．

2 結果與分析

2.1 啟動子Peftu片段的PCR擴增

通過PCR反應擴增Peftu片段產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，在200,bp附近出現特異的單一DNA條帶．將PCR產物與pMD19-T Simple Vector連接后進行測序，經過DNA序列比對，PCR產物與目的基因序列一致．PCR產物電泳分析結果見圖2．

2.2 pBT2-ETG載體的構建

Kpn,I/Bam,HI雙酶切在大腸桿菌中構建的pBT2-ETG載體，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示在200,bp與8,kbp附近分別出現DNA條帶，與預計的目的片段大小一致，初步證明啟動子Peftu已成功地克隆到pBT2-Tat-GFP載體中．酶切產物電泳分析結果見圖3．

2.3 肉葡萄球菌的轉化驗證

肉葡萄球菌培養物經玻璃微珠破壁，使用GeneBond試劑盒提取pBT2-ETG質粒，Kpn I/Bam HI雙酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，在200,bp和8,kbp附近出現DNA條帶，與預計的目的基因片段大小一致，說明穿梭載體pBT2-ETG已成功轉化入肉葡萄球菌宿主中．肉葡萄球菌重組質粒pBT2-ETG的Kpn,I和Bam HI雙酶切驗證分析結果見圖4．

2.4 熒光顯微鏡觀察

使用NIKON ECLIPSE TE2000–U型熒光顯微鏡觀察轉化子菌液，結果如圖5所示．

由圖5可以看出，構建成功的重組大腸桿菌和肉葡萄球菌宿主菌株均能發出熒光，說明pBT2-ETG載體編碼的GFP能夠表達并正確折疊，是具有活性的蛋白質．

2.5 SDS-PAGE分析

經玻璃微珠破碎，分別提取S. carnosusTM300重組菌株與對照菌株的細胞壁和原生質體進行SDSPAGE蛋白電泳，結果見圖6．同時對其發酵液進行蛋白電泳分析，以確定GFP是否能夠分泌到宿主細胞外的培養基中．

本研究中，經N-末端修飾的目的蛋白GFP的相對分子質量約為3×104．在圖6中重組菌株細胞壁部位所在的泳道出現了目的條帶，這表明GFP蛋白成功表達并轉運到肉葡萄球菌宿主細胞的細胞壁部位．但是發酵液的蛋白電泳圖在目的位置沒有出現目的條帶，說明GFP蛋白未能分泌到胞外(圖略)．

2.6 Native-PAGE分析

為檢測重組菌株表達的GFP是否具有活性，提取出E. coli DH5α 重組菌株、S. carnosusTM300重組菌株及其對照菌株的細胞壁和原生質體進行了Native-PAGE活性蛋白電泳，結果如圖7所示．

在圖7中可以看出，如箭頭所指方向，GFP目的條帶出現在重組菌株S. carnosusTM300/pBT2-ETG的細胞壁部位(泳道6)，這表明重組菌株S. carnosusTM300/pBT2-ETG表達的活性GFP成功地分泌到了宿主細胞壁部位．

3 結 語

本實驗在構建大腸桿菌–肉葡萄球菌穿梭質粒pBT2-ETG的過程中，先將目的基因與構建的連接產

物高效地轉化入大腸桿菌，通過大腸桿菌繁殖擴增獲得了大量重組質粒，再提取此重組質粒電轉化入肉葡萄球菌，從而較好地解決了連接產物直接轉化肉葡萄球菌效率較低的問題．

穿梭質粒pBT2-Tat-GFP引入的強啟動子Peftu可以使融合基因tat-gfp在大腸桿菌與肉葡萄球菌宿主中均得到高效表達，并通過Tat信號肽的作用，將GFP正確折疊并轉運至肉葡萄球菌細胞壁部位．該強啟動子通過提高外源蛋白在肉葡萄球菌中的表達效率，使得pBT2表達載體系統易于進行克隆操作．本研究的成果也為相應的細胞表面展示與活菌疫苗等的研發奠定了理論與應用的基礎．

致謝：本文受天津市高等學校科技發展基金資助(項目編號：20120803)，謹致謝忱！

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責任編輯：常濤

GFP Translocation of Twin-arginine Secretion Pathway in Staphylococcus carnosus

GAO Qiang1，XU Baoyin1，CHENG Yibing1，WANG Lin2，ZHANG Chaozhen1，TIAN Pingping1

(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Computer Science and Information Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300222，China)

According to the genome sequence ofStaphylococcus carnosusTM300 genome，a pair of primers was designed for PCR amplification of promoter Peftu of tufA gene. The PCR-amplified promoter Peftu fragment was cloned into plasmid pBT2-Tat-GFP and chemically transformed into E. coli host. A shuttle vector pBT2-ETG was thereby constructed and successfully transformed intoE. coli and S. carnosusTM300 hosts，respectively. The experimental results reveal that GFP was expressed by theE. coli-Staphylococcusshuttle vector pBT2-ETG in bothE. coliandS. carnosushosts. The expressed GFP was translocated to the cell walls of S. carnosus host in fluorescent active form. Thereby，a preliminary experimental basis was laid for the further study of other exogenous protein secretion via twin-arginine translocation pathway inS. carnosus.

Staphylococcus carnosus；GFP；twin-arginine translocation pathway；promoter Peftu；Tat signal peptide

Q933

A

1672-6510(2014)05-0001-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.001

2014–01–18；

2014–04–20

國家自然科學基金資助項目(31370075，31101275)；國家高技術研究發展計劃“863計劃”資助項目(2012AA021302)

高 強（1965—），男，陜西府谷人，教授，gaoqiang@tust.edu.cn.