紅樹林沉積物中產氫微生物的分離鑒定和性能分析

朱大玲，楊振芳，潘光華

(天津市海洋化學與資源重點實驗室，天津科技大學海洋科學與工程學院，天津 300457)

紅樹林沉積物中產氫微生物的分離鑒定和性能分析

朱大玲，楊振芳，潘光華

(天津市海洋化學與資源重點實驗室，天津科技大學海洋科學與工程學院，天津 300457)

采用厭氧富集三層平板和螺口試管培養法，根據產氣特征從紅樹林沉積物中篩選分離海水條件下的高效產氫菌株，獲得1株兼性厭氧具有較高產氫能力的菌株BH-16．通過形態觀察、Biolog鑒定和16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為摩氏摩根氏菌BH-16．實驗表明：在厭氧培養條件下，菌株BH-16的最適起始pH、NaCl質量濃度和培養溫度分別為8.0、0.01 g/mL、37,℃．通過間歇產氣實驗和氣相色譜分析對菌株的產氫能力進行分析，結果表明：菌株BH-16大量產氫發生在細胞指數生長后期和細胞生長平穩期；在海水培養條件下，在起始葡萄糖質量濃度為20 g/L、起始pH為7.2時，菌株的總產氫量和平均產氫速率分別為1,120 mL/L和93.3 mL/(L·h)．

紅樹林沉積物；摩氏摩根氏菌；分離鑒定；發酵產氫

氫氣以清潔、可再生等特點被認為是最有希望的石油燃料替代品．與熱化學或是電化學制氫過程相比，生物制氫過程因其對環境友好，投入能量少等特點而倍受關注[1]．生物制氫主要為光合生物制氫和非光合生物制氫．其中，暗發酵微生物制氫可以在無光條件下厭氧發酵制氫，使得生物反應器的設計較光合微生物制氫簡單，應用前景更廣．已報道的暗發酵產氫微生物有腸桿菌(Enterobacter)、芽胞桿菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)、成團泛菌(Pantoea)等[2–6]，其中部分是專性厭氧菌，部分是兼性厭氧菌．與專性厭氧菌相比，兼性厭氧菌對氧氣的不敏感性使其在培養和應用方面表現出很大的優勢．截至

目前，對產氫細菌的報道主要集中在淡水領域，有關海水或高鹽環境的產氫微生物報道相對較少．

我國的海水養殖業居世界第一．采用的集約化養殖模式使得海水養殖廢水有機質和氨氮含量超標嚴重，這些養殖廢水的直接排放勢必使得當地的環境質量降級[7]．更甚者，沿岸海域的富營養化常導致有害水華的發生，所以對海水養殖有機廢水處理是非常必要的．此外，因淡水資源的短缺，部分沿海城市直接利用海水作為工業用水或是生活用水，由此也將產生大量的高鹽有機廢水，在排放之前也需進行處理.目前，厭氧處理有機物產生氫氣和二氧化碳來處理淡水有機廢水和廢物的技術已經比較成熟[8]，因此利用海洋廢水和有機廢物進行微生物制氫技術在理論上是可行的．而利用海水養殖廢水或高鹽有機廢水進行發酵制氫的前提條件是產氫海洋細菌或產氫耐鹽細菌的篩選．

許多研究報道從淡水環境中篩選產氫微生物，例如城市垃圾、下水道污泥和池塘污泥等[2–3]．而分離自海洋環境或是高鹽環境的產氫微生物的研究報道較少．在多種多樣的海洋環境中，紅樹林沉積物是用來篩選產氫微生物的良好材料．紅樹林是位于熱帶和亞熱帶的一類特殊的生態環境[9]，其沉積物營養非常豐富、微氧及鹽度梯度變化等特點使得該底泥中細菌種群呈多樣性分布．本研究從紅樹林沉積物中分離獲得了1株海水暗發酵產氫細菌，采用16S rDNA序列分析和Biolog鑒定方法對該菌株進行鑒定，并對其培養條件和產氫能力進行了分析，以期為利用海水養殖有機廢水或高鹽有機廢水進行微生物發酵產氫提供候選產氫菌株．

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗用沉積物采自我國廣西省北海市(108°50′～109°47′E，21°29′～21°55′N)的紅樹林保護區潮間帶．采樣點處于低潮帶、離地表30～40,cm處．采樣后污泥密封4,℃保存，維持細菌種群的多樣性．

1.2 培養基

菌群富集和菌株分離所用培養基LM-H，根據李永峰等[10]LM-1培養基進行改良(g/L)：葡萄糖20.0，胰蛋白胨4.0，牛肉膏2.0，酵母粉1.0，NaCl 30.0，K2,HPO41.5，MgCl20.1，FeSO4·7H2O 0.1，L-Cysteine 0.5，微量元素液(MnSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.05，H3BO30.01，CaCl2·2H2O 0.01，Na2,MoO40.01，CoCl2·6H2O 0.2)10,mL，維生素溶液(L–抗壞血酸Vc 0.025，檸檬酸0.02，吡哆醛0.05，對氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，維生素B10.02，核黃素0.025) 10,mL，瓊脂20.0或不加瓊脂；pH 7.2～7.5．

1.3 產氫菌群富集

將3,g(濕質量)沉積物接種到裝有100,mL培養基的150,mL血清瓶中．充氮氣15,s后迅速蓋上橡皮塞子，創造厭氧環境．將血清瓶放入搖床，于37,℃振蕩培養24,h．取1,mL培養物加入新鮮的100,mL培養基中，相同的條件下培養24,h，重復3次，以達到富集產氫微生物目的．

1.4 菌株分離與純化

采用對文獻[11]方法進行改進的三層平板法，步驟如下：LM-H培養基經滅菌后無菌條件下倒平板，待冷卻凝固后用稀釋菌液進行涂布；涂布后正置5,min，再倒入一層普通瓊脂；待冷凝后，傾入一層固體石蠟，密閉平板已達到厭氧條件．待固體石蠟凝固徹底之后，蓋上平皿，37,℃倒置培養24,h．挑取培養出的單個菌落接種于裝滿LM-H液體培養基的螺口試管中，37,℃正置培養48～72,h．將螺口試管倒置，觀察產氣的高度．選取產氣量較大的試管進行編號，進行分離、純化及產氫實驗，以獲得產氫的兼性厭氧或嚴格厭氧微生物．

1.5 形態學和生理生化實驗

通過光鏡(Olympus，日本)對菌體的形態進行觀察．生理生化實驗采用Biolog鑒定系統，具體步驟參照Biolog操作手冊(Biolog，美國)．

1.6 16S rDNA序列測定及序列分析

細菌基因組DNA提取采用酚–氯仿抽提法．根據Pitcher等[12]的描述稍作改動：取待測微生物菌種接種于LM-H培養基，充氮氣達到厭氧條件(操作步驟見1.3)，密封后37,℃振蕩培養24,h，5,000,r/min離心10,min收集菌體，用TE緩沖液洗滌2次；菌體重懸于200,μL TE緩沖液，加入溶菌酶(25,μg/mL)混勻，65,℃孵育1,h；加入蛋白酶K(250,μg/mL)和10% SDS 10,μL混勻，55,℃孵育30,min，溶菌產物暫時置于冰上．加入等體積的抽提液(V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)＝25∶24∶1)，抽提2次，取上層水相．加入2.5倍體積的預冷無水乙醇沉淀．沉淀DNA重溶于無菌水中，－20,℃保存備用．

以基因組DNA為模板PCR擴增16S rRNA基因，引物按文獻[13]報道，在上海生工生物工程技術服

務有限公司合成，序列如下：8,F(5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′)．反應體系采用25,μL體系：10×Ex Taq Buffer 2.5,μL，dNTP Mixture(各2.5,mmol/L)

2,μL，引物(20,μmol/L)各1,μL；模板DNA 1,μL；TaKaRa Ex Taq(5,U/μL)0.125,μL；加滅菌蒸餾水至25,μL．按以下步驟進行PCR循環：94,℃預變性2,min；94,℃ 30,s，55,℃ 30,s，72,℃ 2,min，35個循環；72,℃延伸10,min．

取5,μL PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠(含適量的EB)電泳，用Gene-Genius凝膠成像系統拍照、記錄和分析．擴增產物用凝膠純化試劑盒純化后進行序列測定，測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成．

根據獲得16S rDNA序列在GenBank中進行Blast搜索同源序列，并以ClusterX軟件進行多重序列比對．通過MEGA 4.0等軟件，以鄰接法(neighbourjoining)建立系統進化樹，Bootstrap置信值估算重復次數1,000次[14]．

1.7 培養條件的優化

無菌LM-H培養基裝滿無菌螺口試管(10,mL)，按無菌操作接種菌液5,μL．37,℃靜置培養24,h，混勻后用分光光度計(UV757CRT，中國)測定培養液在600,nm波長處的吸光度．分別對影響生長的起始pH(4～10)、培養溫度(15～42,℃)、NaCl質量濃度(0～0.05,g/mL)3個主要條件進行單因素實驗，其他條件相同．

1.8 間歇產氣實驗及產氫過程中理化因子的變化

無菌操作接種菌液5,μL到裝有100,mL LM-H培養基的150,mL血清瓶中；充氮氣15,s后迅速蓋上橡皮塞子，以創造厭氧環境；將血清瓶放入搖床37,℃、130,r/min振蕩培養26,h；采用排水法收集氣體．在間歇產氣實驗中，根據產氣情況分別在產氣前、產氣中和產氣后取樣，連續監測厭氧發酵系統的pH和氧化還原電位(ORP)．pH和氧化還原電位采用DLELTA–320型酸度計進行測量；氫氣含量采用GC–2010型氣相色譜儀(中國滕州)測定，氮氣作為載氣，橋流70,mA；柱室、熱導池、汽化室的溫度分別為70、100、80,℃．

2 結果與討論

2.1 菌株的分離和鑒定

從紅樹林沉積物中分離獲得1株產氫菌株BH-16，該菌株為兼性厭氧菌株，在有氧條件下生長速度慢．光鏡形態觀察菌株為短桿狀的革蘭氏陰性菌．采用Biolog鑒定系統分析菌株利用碳源的情況表明：菌株BH-16能夠利用95種碳源中的33種(表1)，在數據庫中進行比對，沒有找到結果相似的菌株．

經PCR擴增和序列測定獲得菌株BH-16的16S rDNA序列，長度為1,418,bp，GenBank登錄號為FJ219587．16S rRNA基因相似性分析發現菌株BH-16與摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)相似性達到99%．采用NJ法構建系統進化樹，結果菌株BH-16與摩氏摩根氏菌歸為一類(圖1)．綜合形態學觀察、Biolog鑒定和16S rRNA基因序列分析結果，菌株BH-16被鑒定為摩氏摩根氏菌，定名為摩氏摩根氏菌M. morganiiBH-16．

許多腸桿菌屬菌株已被報道能夠利用碳水化合物進行發酵制氫，例如：E. cloacaeIIT-BT08、E. asburiaeSNU-1、E. aerogenes HU-101、Pantoea agglomeransBH-18等[2,15–17]．摩氏摩根氏菌隸屬于腸桿菌科摩根氏菌屬，目前尚未見有關利用此菌進行產氫研究的報道．

2.2 生長條件的優化

為深入開發利用產氫菌株BH-16，分析了該菌株在厭氧條件下起始pH、培養溫度和NaCl質量濃度對生物量積聚的影響．結果表明：厭氧條件下起始pH對生物量的積聚影響顯著(圖2)，菌株BH-16的最適起始pH為8.0；菌株在0～0.05,g/mL的NaCl質量濃度下都能夠存活，且在0.01～0.03,g/mL條件下生長狀況較好，具有較好的鹽度耐受性(圖3)；菌株在30～42,℃條件下生長狀態良好，最適生長溫度為37,℃(圖4)．

通常海水的pH和NaCl質量濃度分別為7.8～8.2和0.03,g/mL，摩氏摩根氏菌BH-16在此條件下的生長狀態良好，表明菌株在紅樹林特殊的環境中已經完全適應了海水條件，可作為利用海水養殖廢水進行廢水處理的候選菌株進行深入研究．

2.3 菌株BH-16的產氫能力分析

采用間歇產氣實驗方法分析了在海水培養條件下摩氏摩根氏菌BH-16的發酵產氫情況，結果表明在起始葡萄糖質量濃度為20,g/L、起始pH為7.2時，菌株BH-16的總產氫量(以單位體積培養液產生氫氣的體積計)和平均產氫速率分別為1,120,mL/L和93.3,mL/(L·h)．產氫現象主要發生在13～22,h，氫氣的產生始于細胞生長指數中期(13,h)，在細胞生長指數后期(16,h)產氫速率達到最高，氫氣主要產生于細胞生長指數后期和生長平穩早期．

菌株BH-16發酵產氫過程中生物量的積聚、pH值和氧化還原電位的監測如圖5所示．產氫過程中發酵液的pH從6.0降至4.5，ORP維持在－82～－72,mV．腸桿菌科細菌發酵類型多為混合酸發酵，在利用葡萄糖發酵產氫的過程中，伴隨產生乳酸、乙酸和乙醇等產物[18]．pH降低主要是由于有機酸乳酸和乙酸的積聚導致的．ORP是表明溶液的氧化和還原性質的指標，與pH、鹽度、有機物等因子相關，常用于廢水處理過程中一個有效的調控因子[19]．高產氫速率通常發生在發酵系統處于低ORP和適合的pH范圍內，所以pH和ORP可作為提高產氫速率的調控指標，摩氏摩根氏菌BH-16的高產氫速率發生在pH為5.2和ORP為－82,mV時．

3 結 語

從紅樹林沉積物中分離獲得1株產氫的兼性厭氧革蘭氏陰性菌，通過形態學、生理生化和分子生物學等方法鑒定，確定其為摩氏摩根氏菌BH-16．菌株BH-16的生長條件優化結果表明，該菌株適合在海水條件下生長．間歇產氣實驗表明：摩氏摩根氏菌BH-16具有較高的產氫能力，在起始葡萄糖質量濃度為20,g/L、起始pH為7.2的海水培養條件下，菌株的總產氫量和平均產氫速率分別為1,120,mL/L和93.3,mL/(L·h)，可作為利用海水養殖廢水微生物發酵制氫的候選菌株進行深入研究．

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責任編輯：常濤

Isolation and Characterization of a Morganella morganii Strain with Hydrogen-producing Activities from the Mangrove Sediments

ZHU Daling，YANG Zhenfang，PAN Guanghua
(Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

According to the property of gas production，highly hydrogen-producing bacterial strain BH-16 was screened in the culture condition of marine water from the mangrove sediment. The screening and isolation of the strain were realized with the methods of anaerobic enrichment，three-layer plate and the culture in the tube with nut. Strain BH-16 was identified and designated asMorganella morganiiwith light microscopic examination，Biolog test and 16S rDNA sequence analysis. Experiments show that in the anaerobic culture，the optimum initial pH value，NaCl concentration and temperature for cell growth were 8.0，0.01 g/mL and 37,℃，respectively. During fermentation，hydrogen started to evolve when cell growth entered the middle-exponential phase and was mainly produced in the late-exponential phase and the stationary phase. The total hydrogen-production yield(1,120 mL/L)and the overall hydrogen production rate(93.3 mL/(L·h))were obtained at an initial glucose concentration of 20 g/L and an initial pH value of 7.2 in marine culture conditions.

mangrove sediments；Morganella morganii；isolation and identification；hydrogen production by fermentation.

Q935

A

1672-6510(2014)05-0029-06

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.007

2013–12–18；

2014–05–04

天津市自然科學基金資助項目(12JCQNJC04300)；天津市海洋化學與資源重點實驗室基金資助項目(201203)

朱大玲（1978—），女，山東蓬萊人，副研究員，zhudaling@tust.edu.cn.