pgpA和tdcG基因的敲除對大腸桿菌磷脂酰絲氨酸合成的影響

劉逸寒，喬 婧，李 玉，佟新偉，劉曉光，路福平

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

pgpA和tdcG基因的敲除對大腸桿菌磷脂酰絲氨酸合成的影響

劉逸寒，喬 婧，李 玉，佟新偉，劉曉光，路福平

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

磷脂酰絲氨酸具有改善大腦的認知和記憶的功能，是醫藥和食品行業重要的原料．為進一步提高大腸桿菌(Escherichia coli)中磷脂酰絲氨酸含量，利用Red重組系統，以可積累磷脂酰絲氨酸的E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)為出發菌株，敲除pgpA和tdcG基因，切斷與磷脂酰絲氨酸合成相關的L-絲氨酸和磷脂酰甘油磷酸的分解代謝途徑．搖瓶發酵后的檢測結果表明，重組菌株E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpA ΔpgpB ΔtdcG)中磷脂酰絲氨酸占菌體總磷脂的比例為2.5%，較出發菌株(1%)提高了1.5倍．

磷脂酰絲氨酸；大腸桿菌；基因敲除；代謝

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)是存在于細菌、酵母、植物、哺乳動物細胞中的一種重要的膜磷脂，是大腦中主要的酸性磷脂．PS有顯著的保健功效，能改善老年阿爾茨海默病、提高認知力、抗抑郁、抗壓抑、輔助激活酶等[1]．目前，PS產品主要是由大豆中提取制備，也可由磷脂酶催化磷脂酰膽堿和絲氨酸合成，但此催化反應尚處于實驗室研究階段，且該酶的生產成本較高，催化過程較為復雜．PS作為磷脂成分之一存在于微生物體內，因此，可以利用代謝工程手段對微生物體內PS相關代謝途徑進行改造，以提高PS合成量，通過微生物發酵法為PS的制備提供新思路．

目前，國內外對大腸桿菌磷脂相關代謝進行了大量的研究．在大腸桿菌中，PS由L–絲氨酸和CDP–

二酰基甘油經PS合成酶(phosphatidylserine synthetase，PSS)催化合成(圖1)．Rilfors等[2]發現PSS是一種膜結合酶，當它處于游離狀態時沒有活性，只有和膜上的磷脂酰甘油磷酸(phosphatidylglycerophosphate，PGP)結合后才具有活性，可見PSS的活性受到PGP調節．Icho[3]和Funk等[4]研究表明，pgpA、pgpB、pgpC此3個基因分別編碼3種磷脂酰甘油磷酸酶同工酶PGPA、PGPB、PGPC，該酶催化 PGP 轉化為磷脂酰甘油(phosphatidyl glycerol，PG)．Lu等[5]分別敲除pgpA、pgpB、pgpC后，研究PGP在大腸桿菌的積累，發現此3個同工酶基因同時被敲除后會阻斷PG的生物合成途徑，菌體生長受到限制．另外，Su等[6–7]發現，PS的合成底物之一L–絲氨酸經L–絲氨酸脫氨酶催化后可轉化為丙酮酸，sdaA、sdaB、tdcG分別編碼L–絲氨酸脫氨酶3種同工酶．Voelker[8]研究表明，PS在磷脂酰絲氨酸脫羧酶(phosphatidylserine decarboxylase，PSD)作用下可以合成磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)．Ishinaga等[9]發現，大腸桿菌PSS活力提高有利于PE的合成．Vance等[10]分析了PS在大腸桿菌、酵母、植物和哺乳動物中的功能和分布，并簡述了PSS酶的調節機制．可見，目前有關PS的研究主要是將其作為PE合成的前體分析，而以提高PS合成量為目的的研究尚未見報道．

本課題組在前期研究中，結合基因工程與代謝工程技術，通過敲除E.,coli K12中2個L–絲氨酸脫氨酶基因sdaA、sdaB和1個磷脂酰甘油酸酶基因pgpB，已成功構建并獲得1株PS合成量提高的大腸桿菌重組菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)，其PS占菌體總磷脂含量的1%，而原始菌株E.,coli K12中PS占菌體總磷脂含量＜0.5%．本文在E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)基礎上，進一步敲除磷脂酰甘油磷酸酶pgpA基因和L–絲氨酸脫氨酶tdcG基因，通過積累PGP以提高PSS活性和阻斷L–絲氨酸分解代謝兩個方面進行改造，使PS在大腸桿菌內得到進一步積累，構建PS合成量提高的大腸桿菌重組菌株，為PS的生物合成奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌E.,coliK12、大腸桿菌E.,coli K12 (ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)及所用質粒pKD3、pKD46、pCP20均為本實驗室保存．以pKD3為模板可PCR擴增出兩側含有FRT位點的抗性基因，可作為篩選標記．pKD46溫敏型低拷貝質粒，42,℃不復制，經L–阿拉伯糖誘導后表達Gam、Beta和Exo這3種λ噬菌體重組蛋白．pCP20用于FRT間抗性基因片段的切除．

1.1.2 培養基和培養條件

LB液體培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH 7.0．用于大腸桿菌培養，37,℃、200,r/min搖床振蕩培養．

LB固體培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂20，pH 7.0．用于大腸桿菌培養，37,℃恒溫培養箱靜置培養．

液體和固體培養基在需要時添加氨芐青霉素(終質量濃度100,μg/mL)和氯霉素(終質量濃度為25,μg/mL)．

1.1.3 引物

研究所需引物包括用于擴增同時帶有同源臂和氯霉素抗性基因的引物和鑒定目的基因是否被成功敲除的引物，見表1，下劃線部分為50,bp左右同源臂．

1.2 方法

1.2.1 基因敲除(以敲除基因pgpA為例)

利用Red重組系統對大腸桿菌進行基因敲除(圖2)．該系統的質粒包括模板質粒pKD3、Red酶表達質粒pKD46和FLP表達質粒pCP20．

以大腸桿菌E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)為出發菌株，敲除基因pgpA的步驟為：(1)以pKD3為模板，用pgpA-H1和pgpA-H2引物擴增出帶有同源臂的氯霉素抗性基因，兩端帶有FRT位點，如圖2(a)所示；(2)利用L–阿拉伯糖誘導菌體內的質粒pKD46，使其表達Gam、Beta、Exo三種重組蛋白，并制備成感受態細胞，將上步得到的同源線性片段電轉化入此感受態細胞中，堿性片段上的同源臂與基因組上的同源區域互相識別，如圖2(b)所示；(3)線性片段上的同源臂與基因組上的同源區域同源重組，如圖2(c)所示，用引物pgpA-out1和pgpA-out2鑒定發生同源重組的菌株；(4)將質粒pCP20電轉化入發生同源重組的菌體后，42,℃誘導其表達FLP重組酶，此酶將FRT位點間的序列及1個FRT位點切除，如圖2(d)，用pgpA-out1和pgpA-out2鑒定基因組上抗性基因切除的菌株．

1.2.2 磷脂的提取

取穩定期的菌液離心，用生理鹽水洗滌3次，置于冷凍干燥機，－70,℃干燥12,h，獲得干菌體．按m(干菌體)∶V(提取液)＝1,g∶1,mL的比例加入提取液(V(己烷)∶V(異丙醇)＝3∶2)，振蕩或攪拌48,h后，離心，取上清液加入旋蒸儀，通氮氣旋轉干燥，干燥后，加入1,mL氯仿溶解提取出的總磷脂，取出再用氮氣吹干即得總磷脂待測樣品．

1.2.3 高效液相色譜法測定磷脂酰絲氨酸含量

高效液相色譜分析采用Venusil XBP C18色譜柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)，柱溫為31,℃，流量為1.0,mL/min，檢測器為蒸發光散射檢測器，檢測波長為205,nm；流動相中V(85%磷酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)＝8∶46∶46．

將磷脂酰絲氨酸標準品溶于氯仿中配制成質量濃度分別為0.020,1、0.112,1、0.221,3、0.321,6、0.423,4,mg/mL的標準溶液，然后進行液相色譜分析．磷脂酰絲氨酸的出峰時間在3,min左右，如圖3所示．以峰面積的對數(lg,A)對相應質量濃度的對數(lg,C)進行線性回歸，可得線性回歸方程lg,A＝3.005,2,lg,C＋7.592,2，R2＝0.999,1．

1.2.4 生長曲線的測定

用Bioscreen全自動生長曲線分析儀測定原始菌株E.,coli K12、出發菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和重組菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)的生長曲線，每隔20,min測定2株菌在λ＝600,nm處的吸光度(A600)，繪制所得突變菌株的生長曲線．

2 結果與分析

2.1 E.,coli,K12(ΔpgpA,ΔpgpB,ΔsdaA,ΔsdaB)的構建(pgpA基因的敲除)

2.1.1 帶有FRT位點的同源線性片段擴增

在E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)的基礎上，敲除基因pgpA，首先要獲得帶同源臂的氯霉素抗性片段，兩端帶有FRT位點，以pKD3為模板，引物為pgpA-H1和pgpA-H2，所得PCR產物大小約為1,133,bp，如圖4(a)所示．

2.1.2 同源重組后轉化子的篩選

將得到的抗性基因線性片段電轉化入上述經誘導含有重組酶的感受態細胞內．經氯霉素抗性平板篩選抗性菌株，并用引物pgpA-out1和pgpA-out2對篩選得到的菌株進行菌落PCR鑒定，pgpA基因全長519,bp，由于驗證引物的位置處于同源臂的外圍，因此，出發菌株驗證引物間的大小應為1,035,bp，而發生同源重組后的菌株，其驗證引物間的大小應為1,549,bp．如圖4(b)所示，條帶與預期相符，說明同源重組獲得成功．

2.1.3 切除氯霉素抗性基因的驗證

鑒定成功的陽性菌株經42,℃培養，使溫敏質粒pKD46丟失．然后，將另一溫敏質粒pCP20轉入此重組菌株中，在30,℃下用氯霉素和氨芐青霉素的雙抗性平板篩選．42,℃誘導FLP重組酶表達，挑取普通LA平板上長出的菌落，用引物pgpA-out1和pgpA-out2對丟失質粒pCP20的單菌落進行菌落PCR驗證，出發菌株驗證引物間的大小應為1,035,bp，而抗性基因切除后的菌株，其驗證引物間的大小應為611,bp．結果如圖4(c)所示，待鑒定菌株有1條大于500,bp的條帶(泳道4)，對照菌株1,000,bp附近有1條帶(泳道5)，與預期相符，說明抗性基因切除成功，得到菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB)．

2.2 E.,coli,K12(ΔpgpA,ΔpgpB,ΔsdaA,ΔsdaB,ΔtdcG)的構建(tdcG基因的敲除)

按照與1.2.1類似步驟驗證tdcG基因的敲除，用含有50,bp同源臂的引物tdcG-H1和tdcG-H2擴增兩端帶有FRT位點的氯霉素抗性基因，所得PCR產物大小為1,133,bp，如圖5(a)所示(泳道1)．

線性片段與基因組發生同源重組后，用引物tdcG-out1和tdcG-out2對篩選得到的氯霉素抗性菌株進行菌落PCR鑒定，如圖5(b)所示．出發菌株驗證引物間的大小應為1,801,bp，而發生同源重組后的菌株，其驗證引物間的大小應為1,585,bp．從泳道2、3可以看出，待鑒定菌株有1條略大于1,500,bp的條帶，對照菌株有1條處于1,500,bp和2,000,bp的條帶，與預期相符，說明同源重組獲得成功．

抗性基因切除后，用引物tdcG-out1和tdcG-out2進行菌落PCR驗證，結果如圖5(c)所示．出發菌株驗證引物間的大小應為1,801,bp，而抗性基因切除后的菌株，其驗證引物間的大小應為647,bp．圖5(c)中對照菌株有1條位于1,500,bp和2,000,bp的條帶(泳道4)，待鑒定菌株有1條處于500,bp和750,bp的條帶(泳道5)，與預期相符，說明抗性基因切除成功，獲得菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)．

2.3 磷脂酰絲氨酸含量分析

原始菌株、出發菌株和重組菌株中磷脂酰絲氨酸的含量見表2．由表2可以看出：出發菌株比原始菌株中PS的積累量提高了約1倍，為1%，繼續敲除磷脂酰甘油磷酸酶基因pgpA時，菌株的PS積累量提高為1.5%；繼而敲除L–絲氨酸脫氨酶tdcG時，PS的產量可獲得進一步提高，最高能達到2.5%左右.

2.4 磷脂酰絲氨酸的積累對生長情況的影響

在400,μL的LB培養基中，培養原始菌E.,coli K12、出發菌E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和重組菌E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)并繪制出各個菌株的生長曲線，如圖6所示．由圖6可以看出：在穩定期，菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)的菌液吸光度均明顯低于原始菌株E.,coli K12，且E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和E.,coli K12((ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)不再有二次生長現象．分析其原因是：sdaA、sdaB、tdcG基因的敲除阻斷了L-絲氨酸脫氨為丙酮酸的途徑，導致菌體內丙酮酸合成速率受到一定影響；同時，pgpA、pgpB基因的敲除影響心磷脂的合成，從而主要減弱線粒體膜的合成，使菌體生長受到抑制．

3 結 論

本文利用Red重組系統對大腸桿菌磷脂相關代謝途徑進行改造，獲得重組菌株E.,coli K12(ΔpgpA

ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)，成功阻斷L–絲氨酸的分解代謝和磷脂酰甘油磷酸的部分代謝．將原始菌株E.,coli K12、出發菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和重組菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)進行搖瓶發酵，發酵20,h后利用高效液相色譜分析菌體PS的含量，重組菌株PS在總磷脂的含量是出發菌株的2.5倍；但經途徑改造后，菌株生長變緩，不再有二次生長現象，說明途徑改造使PS積累的同時，導致菌體生長速度受到限制．實驗表明，通過改造代謝途徑可以提高PS在大腸桿菌中的含量，為大腸桿菌發酵制備PS奠定了基礎．

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責任編輯：常濤

Effect of Gene pgpA and tdcG Knock-off on the Phosphatidylserine Biosynthesis in Escherichia coli

LIU Yihan，QIAO Jing，LI Yu，TONG Xinwei，LIU Xiaoguang，LU Fuping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Phosphatidylserine(PS)is an important active ingredient for medicine and food industry which could improve the cognitive ability and memory. In order to improve the content of PS inEscherichia coli, the Red recombinant system was used for deleting the gene pgpA and tdcG in E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)which can accumulate PS to block the L-serine degradation and cutting off the phosphatidylglycerophosphate catabolic pathway. After fermentation，the results showed that the total PS phospholipids synthesized by the mutant strain E. coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)was 2.5% which was 1.5 times higher than that in the starting strain(1%).

phosphatidylserine；Escherichia coli；gene knock-off；metabolic

Q784

A

1672-6510(2014)06-0001-06

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.001

2014–04–15；

2014–06–15

國家自然科學基金資助項目(21076159)；國家高技術研究發展計劃“863計劃”資助項目(2012AA022108)

劉逸寒（1982—），男，天津人，副教授；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.