羥基喜樹(shù)堿10，20位雙取代衍生物的合成及活性評(píng)價(jià)

郭 娜，江 都，溫少鵬，滕玉鷗

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

羥基喜樹(shù)堿10，20位雙取代衍生物的合成及活性評(píng)價(jià)

郭 娜，江 都，溫少鵬，滕玉鷗

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

根據(jù)喜樹(shù)堿類(lèi)藥物的構(gòu)效關(guān)系和前藥設(shè)計(jì)理念，設(shè)計(jì)和合成了一系列新的10，20位雙氨基甲酸酯取代的羥基喜樹(shù)堿衍生物，且均為新化合物．體外細(xì)胞活性測(cè)試結(jié)果表明：這些化合物的細(xì)胞毒作用比喜樹(shù)堿明顯降低，可作為前藥先導(dǎo)物進(jìn)行更深入研究．

喜樹(shù)堿；抗腫瘤；合成

喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿是從喜樹(shù)中分得的微量生物堿類(lèi)化合物[1]，對(duì)多種腫瘤具有明顯的抑制作用，其作用靶點(diǎn)是拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopoI)．喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿具有較強(qiáng)毒副作用，容易出現(xiàn)不良反應(yīng)，同時(shí)溶解性差，因此國(guó)內(nèi)外研究者一直致力于尋找高效低毒的喜樹(shù)堿衍生物，希望可以使藥物選擇性地分布于腫瘤部位，從而減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性，或者因安全性提高使得用藥量以及用藥次數(shù)增加[2–3]．達(dá)到上述目的的方法之一是以前藥的形式將藥物制作成相對(duì)非毒性的制劑，待藥物到達(dá)腫瘤部位時(shí)再被激活生成活性形式．

喜樹(shù)堿常見(jiàn)的另一問(wèn)題是其20位羥基內(nèi)酯的不穩(wěn)定性，在中性至堿性條件下容易水解開(kāi)環(huán)成為非活性的羧酸鹽．已有構(gòu)效關(guān)系表明，內(nèi)酯環(huán)與20位裸露的羥基是該類(lèi)化合物抗腫瘤活性所必需的結(jié)構(gòu)特征，將20位羥基衍生化后會(huì)導(dǎo)致活性下降，但同時(shí)內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性增加[4]，這是因?yàn)?0位羥基可以與內(nèi)酯的羰基基團(tuán)形成分子內(nèi)氫鍵，加速內(nèi)酯的水解，而20位衍生化后破壞了此氫鍵作用，從而使內(nèi)酯結(jié)構(gòu)穩(wěn)定．因此，20位進(jìn)行適當(dāng)?shù)难苌侵苽湎矘?shù)堿前藥最普遍的方法[5–7]．最常見(jiàn)的衍生化是將20位羥基成酯[8–9]，但酯基在生理pH條件下容易水解，同時(shí)體內(nèi)的多種水解酶也可水解酯基，選擇性差，因此不是制備前藥的理想基團(tuán)．

2004年，Pessah等[10]報(bào)道了一系列喜樹(shù)堿20位氨基碳酸酯連接橋連接的衍生物，該連接橋可被青霉素G酰化酶或催化抗體38C2選擇性去除，釋放出原藥．因此，該連接橋在前藥研究中具有較好的應(yīng)用前景，本文研究也正是采用了氨基甲酸酯這一連接橋．

由于羥基喜樹(shù)堿比喜樹(shù)堿毒性稍小，抗瘤譜更

廣，因此本文選擇羥基喜樹(shù)堿為原藥，在其10位、20位同時(shí)以氨基甲酸酯為連接橋連接不同的親水含氮基團(tuán)，目的是通過(guò)對(duì)羥基喜樹(shù)堿雙取代的修飾在形成前藥的同時(shí)獲得比20位單取代衍生物更好的水溶性.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羥基喜樹(shù)堿，化學(xué)純，上海龍翔醫(yī)藥科技有限公司；對(duì)硝基氯甲酸苯酯等試劑，化學(xué)純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司．

6120型高效液相–質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)，安捷倫科技有限公司；AV–400型核磁共振儀，布魯克光譜儀器公司．

1.2 合成方法

羥基喜樹(shù)堿的10位、20位均有羥基官能團(tuán)，但反應(yīng)活性不同，10位羥基的反應(yīng)活性高于20位，控制反應(yīng)條件和試劑當(dāng)量可以選擇性地在10位發(fā)生反應(yīng)，在增加試劑當(dāng)量或反應(yīng)條件劇烈的情況下可以得到10，20位雙取代的產(chǎn)物．據(jù)此，設(shè)計(jì)了一條簡(jiǎn)便易行的合成路線合成目標(biāo)化合物，見(jiàn)圖1．

1.2.1 中間體的合成

取5,g(13.72,mmol)10–羥基喜樹(shù)堿溶于500,mL無(wú)水二氯甲烷(DCM)中，于冰浴下加入16.77,g (137.2,mmol)4–二甲氨基吡啶(DMAP)，再加入16.6,g(82.34,mmol)對(duì)硝基氯甲酸苯酯，冰浴下攪拌15,min，在室溫下反應(yīng)10,h．TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，用300,mL飽和氯化鈉水溶液洗滌3次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，加入乙醚使產(chǎn)物析出，過(guò)濾，干燥，得8.1,g 10，20–二(4–硝基碳酸苯酯)–喜樹(shù)堿，即化合物1．

1.2.2 目標(biāo)產(chǎn)物的合成

取0.5,g(0.72,mmol)10，20–二(4–硝基碳酸苯酯)–喜樹(shù)堿(化合物1)溶于3,mL無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)，冰浴下加入0.22,mL(2.88,mmol)正丙胺，攪拌．TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，向反應(yīng)混合物中加入15,mL飽和氯化鈉水溶液，用25,mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝175∶1，200目硅膠柱層析純化，得0.19,g固體化合物2．

化合物3—化合物6的合成方法與化合物2相同，只是含氮試劑分別為正丁胺、二乙胺、四氫吡咯和嗎啉．

1.3 活性測(cè)試

采用MTT法檢測(cè)目標(biāo)化合物(化合物2—化合物6)和中間體(化合物1)對(duì)HepG2(人肝癌細(xì)胞)、K562(人白血病細(xì)胞)和HT-29(結(jié)腸癌細(xì)胞)3種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性．

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的表征數(shù)據(jù)

2.1.1 化合物1

ESI-MS(m/z)：693.4[M–H]-.1H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.955～0.991(m，3,H)，2.249～2.329 (m，2,H)，5.338(s，2,H)，5.569(d，J＝6.0,Hz，2,H)，7.293(s，1,H)，7.529(d，J＝9.2,Hz，2,H)，7.769(d，J＝9.2,Hz，2,H)，7.971～8.001(m，1,H)，8.215(d，J＝2.4,Hz，1,H)，8.278～8.321(m，3,H)，8.395(d，J＝9.2,Hz，2,H)，8.754(s，1,H).

2.1.2 化合物2

ESI-MS(m/z)：533.6[M–H]-.1,H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.711～0.810(m，3,H)，0.845～0.935 (m，6,H)，1.332～1.386(m，2,H)，1.497～1.551(m，2,H)，2.058～2.128(m，2,H)，2.828～2.891(m，2,H)，3.056～3.105(m，2,H)，5.305(s，2,H)，5.436(d，J＝3.2,Hz，2,H)，7.024(s，1,H)，7.629～7.657(m，1,H)，7.764～7.792(m，1,H)，7.891(d，J＝2.4,Hz，1,H)，7.979～8.007(m，1,H)，8.175(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.662(s，1,H).

2.1.3 化合物3

ESI-MS(m/z)：561.3[M–H]-.1,H NMR(d6-DMSO，400,MHz)，δ：0.711～0.815(m，3,H)，0.891～0.937 (m，6,H)，1.2～1.251(m，2,H)，1.294～1.383(m，4,H)，1.460～1.515(m，2,H)，2.052～2.123(m，2,H)，2.890～2.905(m，2,H)，3.091～3.140(m，2,H)，5.307(d，J＝3.2,Hz，2,H)，5.435(d，J＝2.4,Hz，2,H)，7.021(s，1,H)，7.626～7.654(m，1,H)，7.739～7.767 (m，1,H)，7.885(d，J＝2.4,Hz，1,H)，7.948～7.976 (m，1,H)，8.164(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.66(s，1,H). 2.1.4 化合物4

ESI-MS(m/z)：561.4[M–H]-.1,H NMR(CDCl3，400,MHz)，δ：0.973～1.010(m，3,H)，1.063～1.098 (m，3,H)，1.237～1.271(m，4,H)，1.306～1.374(m，6,H)，2.104～2.157(m，1,H)，2.241～2.312(m，1,H)，3.209～3.262(m，2,H)，3.399～3.577(m，6,H)，5.270(d，J＝6.0,Hz，2,H)，5.398(m，1,H)，5.676(d，J＝13.6,Hz，1,H)，7.357(s，1,H)，7.655～7.738(m，1,H)，8.274(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.350(s，1,H).

2.1.5 化合物5

ESI-MS(m/z)：557.5[M–H]-.1,H NMR(CDCl3， 400,MHz)，δ：0.958～0.995(m，3,H)，1.846～1.896(m，2,H)，1.946～2.045(m，6,H)，2.104～2.158(m，1,H)，2.269～2.323(m，1,H)，3.23～3.275(m，1,H)，3.353～3.397(m，1,H)，3.522～3.555(m，2,H)，3.617～3.663(m，4,H)，5.206～5.318(m，2,H)，5.407(d，J＝13.2,Hz，1,H)，5.67(d，J＝17.2,Hz，1,H)，7.343(s，1,H)，7.649(m，1,H)，7.758(d，J＝2.0,Hz，1,H)，8.248(d，J＝9.2,Hz，1,H)，8.343(s，1,H).

2.1.6 化合物6

ESI-MS(m/z)：589.4[M–H]-.1,H NMR(CDCl3，400,MHz)，δ：0.969～1.006(m，3,H)，2.108～2.319(m，2,H)，3.345～3.452(m，2,H)，3.485(s，4,H)，3.644(s，4,H)，3.765～3.813(m，6,H)，5.286(t，J＝5.6,Hz，2,H)，5.406(d，J＝13.2,Hz，1,H)，5.683(d，J＝17.2,Hz，1,H)，7.303(s，1,H)，7.657(m，1,H)，7.734(d，J＝2.4,Hz，1,H)，8.263(d，J＝8.8,Hz，1,H)，8.356(s，1,H).

2.2 活性測(cè)試結(jié)果

采用MTT法測(cè)定中間體(化合物1)和目標(biāo)產(chǎn)物(化合物2—化合物6)的體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性，結(jié)果見(jiàn)表1．由表1可見(jiàn)：化合物1—化合物6的活性均顯著低于喜樹(shù)堿，這與20位的羥基為活性必需的結(jié)論是相符的，同時(shí)也說(shuō)明這些化合物符合前藥的基本要求；中間體的抑制活性高于其他化合物，可能是由于中間體的穩(wěn)定性差，在測(cè)試體系中有部分已變回羥基喜樹(shù)堿；化合物4—化合物6的體外活性的降低較為明顯，因此初步判斷它們更適合繼續(xù)進(jìn)行藥理和藥代動(dòng)力學(xué)研究，例如動(dòng)物急毒實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物腫瘤抑制效果評(píng)價(jià)等．

2.3 目標(biāo)產(chǎn)物的脂水分配系數(shù)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察到目標(biāo)產(chǎn)物在水和有機(jī)溶劑中的溶解性相對(duì)喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿均有所改善.

使用Chemdraw Ultra 8.0軟件對(duì)化合物2—化合物6的脂水分配系數(shù)(CLogP)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2．可以看出：化合物2—化合物5的脂溶性明顯增強(qiáng)，而化合物6的性質(zhì)與喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿相當(dāng)．所有目標(biāo)產(chǎn)物的CLogP均小于5，符合Lipinski五規(guī)則，可以預(yù)期該類(lèi)化合物可能具有更好的理化性質(zhì)．

3 結(jié) 語(yǔ)

本文在喜樹(shù)堿類(lèi)藥物已有構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上，選擇上市藥物伊立替康中的氨基甲酸酯連接橋設(shè)計(jì)和合成了一系列10，20位雙取代的喜樹(shù)堿類(lèi)衍生物，該類(lèi)化合物的脂溶性有所改善，同時(shí)體外活性測(cè)試結(jié)果表明這些衍生物細(xì)胞毒作用明顯降低，可作為前藥先導(dǎo)物進(jìn)一步研究．

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責(zé)任編輯：常濤

Synthesis and Biological Evaluation of 10，20-Disubstituted Hydroxycamptothecin Derivatives

GUO Na，JIANG Du，WEN Shaopeng，TENG Yuou
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

According to the structure-activity relationship(SAR)of camptothecin and the concept of prodrug，a novel seires of 10，20-disubstituted camptothecin derivatives with a carbamate linker was designed and synthesized. Biological evaluation in vitro revealed that the cytotoxicity of these analogs was significantly reduced compared with camptothecin，which indicated that these compounds could be further investigated as lead prodrugs.

camptothecin；antitumor；synthesis

R914.5

A

1672-6510(2014)06-0007-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.002

2014–04–01；

2014–05–19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302649)；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(14JCQNJC13200)

郭 娜（1982—），女，河北人，助理研究員；通信作者：滕玉鷗，副教授，tyo201485@tust.edu.cn.