從豬血中提純食品級血紅素的研究

從豬血中提純食品級血紅素的研究

蔣永吉1,2，張翠英1，朱顯明2，易秋分1,2，唐昭娜1,2，董 輝2

(1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457)

利用冰醋酸法從豬血中提純食品級血紅素．以血紅素的純度和得率為響應指標，采用單因素法和響應面法確定冰醋酸法提純血紅素的最佳工藝為：冰醋酸體積(mL)與血球液質量(g)比3.93、氯化鈉添加量2.09%、反應溫度98,℃、反應時間50,min．在該條件下，樣品中血紅素的純度和得率分別為93.29%、60.98%．

豬血；血紅素；冰醋酸法；提取；純度；得率

我國是畜牧業大國，每年肉類產品產量位居世界第一位，每年屠宰生豬獲得的血液副產品約150～200萬噸[1]．豬血中氨基酸含量組成均衡，是一種優質廉價的蛋白質資源，而且含有大量天然的、理想的補鐵劑——血紅素．我國對畜牧血液資源開發利用較晚，血液加工利用率低，不僅造成了巨大的資源浪費，同時也導致了嚴重的環境污染．

據有關報道[2]，全世界有1/5人口患有缺鐵性營養不良，特別是婦女、孩子和老人．缺鐵會導致缺鐵性貧血癥(iron deficiency anemia，IDA)，伴有體力、腦力工作能力下降等癥狀，IDA嚴重威脅人類健康[3–4]．傳統的無機補鐵劑吸收利用率低、腸胃刺激大；隨后的有機補鐵劑雖然緩解腸胃刺激，但生物吸收利用率還是不高，達不到理想防治IDA的目的．血紅素鐵是人體內鐵的主要存在形式，是目前生物吸收利用率最高、腸胃無刺激的生物補鐵劑，是公認的“理想補鐵劑”[5]．目前市場上血紅素產品大部分通過酸性丙酮法制備，該法提純血紅素具有純度高、成本低等特點，但考慮到提純工藝中丙酮的毒性問題，亟需尋找一種更為安全可靠制備血紅素的方法，用于食品和醫療保健行業．

冰醋酸法最早由Schalteief提出，至今還被用于工業化生產．但冰醋酸法提純血紅素存在純度低等缺點．我國鐘耀廣[6]對冰醋酸法提取血紅素進行研究，但是提取的血紅素純度僅50%左右．基于前人的研究成果，本研究以血紅素純度和得率為指標，全面系統地探究冰醋酸法提純血紅素的最佳工藝，為充分開發利用我國畜血資源提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鮮豬血由天津天農康嘉生態養殖有限公司提供；氯化血紅素標準品(純度為98%)，美國Sigma公司；

甲醇、乙腈，分析純，Merck KGaA公司；吡啶，分析純，西隴化工股份有限公司；冰醋酸，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；氯化鈉、檸檬酸鈉，分析純，上海生工生物工程公司．

1.2 實驗儀器

遠紅外鼓風干燥箱；DF–101Z型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；MACH 1.6R型臺式冷凍離心機；XS205型Dual Range電子天平；1260型Agilent高效液相色譜法儀；Venusil MP C18色譜柱(4.6,mm× 150,mm，5,μm)．

1.3 實驗方法

1.3.1 豬血樣品預處理

采集新鮮豬血，加入3.8%檸檬酸鈉抗凝劑，不斷攪拌，防止凝血．5,000,r/min離心20,min，收集血球，分裝后運回實驗室，凍存于－20,℃環境，備用．

1.3.2 鮮血球中血紅素理論含量計算

將凍存于－20,℃的血球置于4,℃環境過夜解凍，量取200,mL充分混勻的解凍血球，于4,℃、5,000,r/min離心20,min，除去未破碎血球和雜質，收集上清備用．取3個潔凈干燥的玻璃培養皿，準確稱量并記錄；準確稱取20,g處理的血球液3份，分別放在標記好的3個玻璃培養皿中；將3個放有血球的培養皿置于105,℃的烘箱中，干燥至質量恒定后，稱量并記錄；計算干物質含量及血紅素理論含量．

1.3.3 工藝流程

將凍存于－20,℃血球解凍破碎→離心→與氯化鈉–冰醋酸溶液共熱→冷卻至室溫→離心收集血紅素晶體→洗滌→烘干．

1.3.4 單因素及響應面實驗設計

影響冰醋酸法提純血紅素的主要因素有冰醋酸體積(mL)與血球液質量(g)比、反應溫度、反應時間、氯化鈉的添加量．按照以上4個因素的不同設置條件進行單因素實驗．

根據單因素實驗結果分析，采用Design Expert 8.0.6.1軟件中Box-Benhnken Design(BBD)法設計4因素3水平響應面實驗，優化冰醋酸法提純血紅素的工藝．

1.3.5 樣品中血紅素的含量和得率的測定

色譜條件[7]：Venusil MP C18色譜柱(4.6,mm× 150,mm，5,μm)；流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)∶V(醋酸)∶V(吡啶)＝40.0∶40.0∶9.0∶1.0∶0.6的混合溶液，流量1,mL/min；柱溫35,℃；檢測波長399,nm；進樣量20,μL．

稱取50,mg待測樣品(或標準品)于50,mL容量瓶中，用0.1,mol/L NaOH定容；取1.25,mL定容后溶液于25,mL容量瓶中，用甲醇定容．

樣品中血紅素純度Y1及得率Y2按照式(1)、式(2)計算.

式中：S樣是待檢測樣品的峰面積；S標是標準樣品的峰面積；m樣是提取樣品的質量；m是血球中血紅素的總質量．

2 結果與分析

2.1 鮮血球中血紅素理論含量的計算

通過3次實驗確定的鮮血球中干物質含量的平均值為26.65%．紅細胞干物質主要是血紅蛋白，占總蛋白的95%～97%[8–9]，且血紅蛋白含有血紅素3.8%.經計算：血紅素占鮮血球濕質量的0.962%～0.982%．

2.2 單因素實驗

2.2.1 冰醋酸體積與血球液質量比

冰醋酸體積(mL)與血球液質量(g)比分別是2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0，NaCl添加量為血球液質量的1.5%，在105,℃的冰醋酸溶液中反應40,min．結果如圖1所示．

由圖1可知：冰醋酸體積與血球液質量比對提取血紅素的純度和得率影響較大．隨著冰醋酸體積與血球液質量比增加，樣品中血紅素純度和得率迅速增加；當冰醋酸體積與血球液質量比達到3.5時，樣品中血紅素的純度和得率幾乎達到最大，不再隨冰醋酸體積與血球液質量比增加而快速增加．考慮到生產過程經濟效益，初步選定冰醋酸體積與血球液質量比

為3.5．

2.2.2 反應溫度

冰醋酸體積與血球液質量比為4.5、NaCl添加量為血球液質量的1.5%，分別在不同溫度的冰醋酸溶液中反應40,min，實驗結果如圖2所示．

由圖2可知：反應溫度對提純血紅素影響也較大．隨著溫度的升高，樣品中血紅素純度和得率迅速增加；當達到95,℃時，血紅素的純度達最高，血紅素的得率幾乎達到最高；當溫度繼續升高時，血紅素純度反而下降，血紅素得率比較穩定．基于生產能耗的考慮，初步選定反應溫度95,℃．

2.2.3 反應時間

冰醋酸體積與血球液質量比4.5、NaCl添加量為血球液質量的1.5%，在105,℃的冰醋酸溶液中反應不同時間，實驗結果如圖3所示．由圖3可知：隨著反應時間的延長，血紅素純度和得率明顯提高；當反應時間為30,min時，血紅素純度達到83.83%，但血紅素得率僅52.07%；繼續延長反應時間，血紅素純度增高緩慢，但血紅素得率增高較快；當反應45,min時，血紅素純度和得率分別達89.01%、61.32%；繼續延長反應時間，血紅素純度和得率趨于穩定．綜合考慮提取血紅素的純度和得率、生產周期、生產能耗等，反應時間初步定為45,min．

2.2.4 氯化鈉添加量

冰醋酸體積與血球液質量比為4.5、添加不同質量的NaCl，在105,℃的冰醋酸溶液中反應40,min，結果如圖4所示．

由圖4可知：氯化鈉添加量對提取血紅素的得率和純度影響相對較小．隨著氯化鈉添加量增加至1.0%，血紅素的純度和得率增加較快；之后，當氯化鈉添加量增加時，血紅素的純度和得率相對穩定；其中氯化鈉添加量達到2.0%時，血紅素純度和得率達到最大．所以，氯化鈉添加量初步確定為2.0%．

2.3 響應面優化

根據單因素實驗分析，以血紅素純度和得率為響應，采用Design Expert 8.0.6.1軟件中Box-Behnken Design中心組合實驗設計原理，進行4因素3水平實驗，確定冰醋酸法提純血紅素的最佳工藝．令：x1為冰醋酸體積(mL)與血球液質量(g)比；x2為氯化鈉添加量；x3為反應時間；x4為反應溫度．因素水平表見表1，方案設計及實驗結果見表2．

將所得的實驗數據采用Design Expert 8.0.6.1軟件進行多元回歸擬合，得到分別以血紅素純度和得率為響應的二次回歸方程為

式中：X1＝(x1－3.5)/0.5，X2＝(x2－2.0)/0.5，X3＝(x3－45)/5，X4＝(x4－95)/5；其中x1、x2、x3、x4為非

編碼值，X1、X2、X3、X4為編碼值．

2.3.1 回歸方程的方差分析

利用Design Expert軟件分別對擬合的回歸方程進行方差分析，分析結果見表3、表4．表3、表4中兩個模型回歸的P都小于0.000,1，說明回歸模擬建立的模型極其顯著；兩模型的失擬P分別為0.240,6和0.339,5，均大于0.05，說明模型失擬不顯著，即模型與實驗數據擬合度良好．該模型回歸高度顯著及失擬不顯著，說明擬合模型有效[10]．

2.3.2 響應曲面圖分析及最佳工藝預測

根據回歸方程，利用Design Expert分別繪制以血紅素純度和得率為響應的響應曲面圖(圖5、圖6)．分析各影響因素對提取血紅素純度和得率的影響及各因素間的交互作用．采用Design Expert中Numerical Optimization對提取血紅素的純度和得率進行最優化設計．得到提取血紅素的得率及純度最佳的提取工藝條件：冰醋酸體積與血球液質量比

3.93、氯化鈉添加量為2.09%、反應溫度97.66,℃、反應時間50,min，預測提取樣品中血紅素的純度和得率分別約為94.26%和62.11%．

2.3.3 最佳工藝驗證實驗

在優化的最佳實驗條件下，即反應溫度98,℃(與最優值最近的整數值)、冰醋酸體積與血球液質量比3.93、NaCl添加量為2.09%、反應時間50,min，提純血紅素，實驗重復5次．在上述條件下，提純樣品中血紅素純度和得率的實驗值分別為93.29%和60.98%．與預測的理論值相接近，說明模型有效且能夠較好地反映出血紅素的提取條件，同時也說明了用響應面法優化冰醋酸法提取血紅素的提取工藝是可行的．

提取樣品和標準品的HPLC色譜圖如圖7所示．由圖7可知：提取樣品和標準品在該條件下主峰的保留時間和峰面積一致，說明實驗提取樣品的主要成分為血紅素．

3 結 語

在單因素實驗設計的基礎上，對冰醋酸法從豬血中提取血紅素的提取工藝進行了4因素3水平的響應面設計，建立了響應值和各個因素之間的數學模型，依據此數學模型確定的最佳提取工藝為：冰醋酸體積與血球液質量比3.93、NaCl添加量為血球液質量的2.09%、反應溫度98,℃、反應時間50,min．在該條件下，提純樣品中血紅素純度和得率的實驗值分別為93.29%和60.98%，與預測值吻合．

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責任編輯：周建軍

Extraction and Purification of Food-grade Heme from Porcine Blood

JIANG Yongji1,2，ZHANG Cuiying1，ZHU Xianming2，YI Qiufen1,2，TANG Zhaona1,2，DONG Hui2
(1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Tianjin International Joint Academy of Biomedicine，Tianjin 300457，China)

Acetic acid was used to purify food-grade heme from porcine blood. To get high yield of purified heme，single factor and response surface methods were performed to optimize the conditions. 2.09% sodium chloride was added into the mixture of blood and glacial acetic acid with the ratio of 3.93 at 98,℃ for 50,min. Under this conditions，the purity and yield of heme are 93.29% and 60.98%，respectively.

porcine blood；heme；glacial acetic acid method；extract；purity；yield

Q81

A

1672-6510(2014)06-0021-06

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.005

2014–03–20；

2014–05–07

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(31300601)；天津市科技型中小企業創新基金資助項目(13ZXCXSY13500)

蔣永吉（1988—），男，江蘇徐州人，碩士研究生；通信作者：董 輝，副研究員，donghui@irm-cams.ac.cn.