一種與膽固醇7，8位脫氫相關蛋白的表達研究

湯 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

一種與膽固醇7，8位脫氫相關蛋白的表達研究

湯 睿，申雁冰，格日勒，牛丹丹，王 敏

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

家蠶(Bombyx mori)的Nvd-Bm蛋白是一種與膽固醇7，8–脫氫酶相關的蛋白．根據NCBI中報道的家蠶中的膽固醇7，8–脫氫酶基因序列(GenBank登錄號：AB232986.1)，采用密碼子優化及基因克隆技術，擴增獲得膽固醇7，8–脫氫酶目標基因nvd-Bm，并構建了重組穿梭載體pPIC9K-nvd-Bm，通過電轉化，成功構建了含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115異源真核表達工程菌株．經SDS-PAGE蛋白電泳分析表明，含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母GS115表達菌株能夠成功表達目標蛋白，為膽固醇的7，8–脫氫產物即7–脫氫膽固醇的生物轉化奠定了基礎．關鍵詞：家蠶；膽固醇7，8–脫氫酶；密碼子優化；畢赤酵母；誘導表達

維生素D是一種作用于鈣、磷代謝的維生素[1]，它能夠維持人及其他動物體內的血磷和血鈣的平衡，促進骨質鈣化以及腸道對鈣磷等元素的吸收[2]．其中最重要的是維生素D2(麥角骨化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)．維生素D3在維生素D生物代謝中活性最高，主要由高級動物的表皮和真皮內含有的7–脫氫膽固醇經紫外線(波長265～228,nm)照射轉變而成，也可來自如肝類、魚肝油等動物組織中[3–5]．而7–脫氫膽醇主要由膽固醇經膽固醇7，8–脫氫酶作用轉變生成，膽固醇7，8–脫氫酶是合成維生素D3的重要生物催化劑．

膽固醇7，8–脫氫酶主要參與蛻皮動物類固醇生物合成過程第一步重要反應，其主要功能是催化膽固醇轉化為7–脫氫膽固醇．目前膽固醇7，8–脫氫酶在分子水平上的作用機制尚不清楚[6]．Yoshiyama等[7]發現，家蠶前胸腺中的neverland基因(nvd-Bm)與7，8–脫氫酶相關．通過RNA干擾和基因敲除技術獲得的nvd-Bm缺失家蠶幼蟲，其體內蛻皮激素的產生量明顯降低而影響其生長，這一干擾可以通過補充7–脫氫膽固醇解除．夏小斌等[8]及Capyk等[9]在秀麗隱

桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發現了功能類似的基因daf-36(GenBank登錄號：NM_073228.4)，并證明該酶屬于Rieske非血紅素鐵加氧酶，包含一段Rieske[2Fe-2S]區域以及一段非亞鐵血紅素關聯區，可催化膽固醇轉化為7–脫氫膽固醇，表明nvd-Bm基因具有編碼膽固醇7，8–脫氫酶的作用．

目前，黃時海等[10]實現了基因nvd-Dm在大腸桿菌中的少量表達，表達效率偏低．本研究主要克隆了來自家蠶的nvd-Bm基因(GenBank登錄號：AB232986.1)，采用密碼子優化技術，構建了nvd-Bm基因的真核表達工程菌并實現了重組Nvd-Bm蛋白的高效表達．研究結果為進一步進行其與伴侶蛋白的共表達研究奠定了基礎．

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115及pPIC9K載體均由本實驗室保存；優化后的nvd-Bm基因及5’AOX1 / 3’AOX1引物，由金唯智公司合成．

引物5’AOX1的序列為：5′-GACTGGTTCCAAT TGACAAGC-3′；引物3’AOX1的序列為：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′．

1.2 培養基、酶及試劑

畢赤酵母GS115培養基的配制方法參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊；大腸桿菌DH5α的培養基采用LB培養基[11]．

EcoRⅠ限制性內切酶、NotⅠ限制性內切酶、DNA Marker、低相對分子質量蛋白Marker，大連寶生物公司；T4,DNA連接酶，Promega公司；Taq PCR Master Mix，博邁德公司；酵母提取物、蛋白胨，Oxiod公司；膠回收試劑盒，北京天恩澤基因公司；其他化學試劑均購自天津市北方天醫化學試劑廠．

1.3 膽固醇7，8–脫氫酶基因的獲取

通過查閱文獻及NCBI中比對，獲得nvd-Bm基因全序列(GenBank登錄號：AB232986.1)；并利用Vector NTI suite 7.0等分子生物學軟件，在不改變其蛋白質氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調整、不穩定序列的刪除、mRNA二級結構等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛性對該序列進行密碼子改造優化[12]．并于目標基因nvd-Bm兩側引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點后，委托金唯智公司進行全基因合成．

1.4 畢赤酵母重組表達菌株的構建

用EcoRⅠ和NotⅠ將由公司合成并連有目標基因的重組克隆載體pUC57-nvd-Bm及畢赤酵母表達載體pPIC9K進行雙酶切，回收1.3,kbp的片段及pPIC9K骨架，回收產物用T4 DNA連接酶進行連接轉化大腸桿菌DH5α，篩選得到重組表達載體pPIC9K-nvd-Bm，對重組表達載體進行PCR鑒定及雙酶切鑒定，并將鑒定正確的轉化子進行測序驗證．

將篩選得到的重組表達載體pPIC9K-nvd-Bm經BglⅡ線性化，電轉入畢赤酵母GS115感受態細胞中，電擊條件：1.5,kV、25,μF、200,?．轉化菌液分別涂布于含4,g/L G418的YPD平板上，30,℃孵育至抗性克隆出現．

挑取抗性克隆，通過玻璃珠和酚氯仿抽提酵母基因組，以基因組為模板，利用5’AOX1/3’AOX1引物進行PCR篩選成功整合的陽性克隆，挑取陽性克隆菌株于YPD培養基中，30,℃培養20,h后，保存甘油管．

1.5 重組質粒在畢赤酵母中的誘導表達及SDSPAGE分析

將篩選出的陽性克隆接種于100,mL BMGY中，30,℃、250,r/min生長至A600≈3，離心收集菌體，轉接于BMMY培養基中30,℃培養，以最終質量分數為0.5%的甲醇溶液進行誘導表達．5,d后離心經甲醇誘導后的培養液上清液轉移至干凈的收集管中，沉淀用裂解緩沖液重懸后通過酸洗玻璃珠渦旋振蕩法進行細胞破碎．分別取菌體培養液上清液及細胞破碎上清液，通過SDS-PAGE分析蛋白表達情況．

2 結果與分析

2.1 膽固醇脫氫酶基因nvd-Bm的獲取及分析

來源于家蠶的膽固醇7，8–脫氫酶基因nvd-Bm(GenBank登錄號：AB232986.1)全長為1,362,bp，GC含量為53.3%．依據表達宿主畢赤酵母的密碼子偏愛性，進行該基因的密碼子優化，改變了其中的335個堿基對，其GC含量由53.3%降低到52.9%，優化后的基因序列見圖1．

NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切的質粒pUC57-nvd-Bm及pPIC9K的電泳圖如圖2所示．從圖2可以看出：泳道1的1.3,kbp片段、泳道2的9.3,kbp片段，分別與目標基因nvd-Bm及pPIC9K預期結果相符合，表明已成功獲得目標基因片段．

2.2 表達載體的構建

重組質粒pPIC9K-nvd-Bm的PCR驗證電泳圖如圖3所示．由圖3可以看出：圖中的1.8,kbp片段，與pPIC9K-nvd-Bm菌液PCR預期結果相符合，表明目標基因nvd-Bm已成功插入畢赤酵母表達質粒pPIC9K中．取圖3中的pPIC9K-nvd-Bm重組質粒進行雙酶切驗證，結果如圖4所示．圖4中均出現了1.3,kbp片段，進一步表明目標基因nvd-Bm已成功插入畢赤酵母表達質粒pPIC9K中．選取圖4中驗證正確的菌株交由公司進行測序，測序結果與目標基因完全一致，表明重組表達載體pPIC9K-nvd-Bm構建成功．

2.3 轉化畢赤酵母重組子的篩選和鑒定

含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌進行基因組PCR驗證，結果如圖5所示．圖5出現的1.8,kbp片段，與重組畢赤酵母GS115基因組PCR預期結果相符，表明目標基因nvd-Bm均已成功整合至畢赤酵母GS115基因組中．

2.4 膽固醇7, 8–脫氫酶的表達

已構建的含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌經甲醇誘導后，分別收集菌體培養液上清液及沉淀．沉淀經細胞破碎后，將菌體培養液上清液及細胞破碎上清分別經蛋白電泳上樣緩沖液重懸煮沸進行SDS-PAGE分析．結果如圖6所示．

由圖6可知：第2泳道，即含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母工程菌培養液在相對分子質量約為6.4× 104的位置存在明顯的特異性條帶，由于轉錄翻譯起始于載體自身的起始密碼子，翻譯時會同時將載體上的起始密碼子至目標基因的起始密碼子間的一段序列一并翻譯出，而該段氨基酸序列相對分子質量約為1.3×104，故表達的蛋白相對分子質量會比實際蛋白相對分子質量5.1×104偏大，約為6.4×104，與預期相對分子質量一致；另外，由于在畢赤酵母中表達的蛋白會受到不同程度的糖基化作用，因而電泳中觀測到的蛋白相對分子質量會比目標蛋白出現不同程度的偏大．進一步經蛋白質譜鑒定，證明其蛋白一級序列與目標蛋白相符，表明目標蛋白得到表達，表達量較高．

3 討 論

化學法合成7–脫氫膽固醇的生產工藝一般需要4步合成反應，轉化率為62%左右，反應途徑長、副產物多、反應條件不易控制[13]．生物轉化法具體高效、綠色的特性，使其成為許多化學藥物和醫藥中間體化學合成工藝的替代技術[14]．

目前雖已有關于基因nvd-Dm在大腸桿菌中表達的相關報道，但由于其未依據大腸桿菌的偏愛性進行密碼子優化，故表達效率偏低．另外，由于目標基因來自于昆蟲細胞，其轉錄翻譯更適合在真核表達體系中進行．本研究對獲得的膽固醇7，8–脫氫酶基因nvd-Bm(GenBank登錄號：AB232986.1)于畢赤酵母中進行了外源表達，并依據畢赤酵母偏愛性進行了密碼子優化，優化后的基因與黃時海等[11]于大腸桿菌中進行的外源表達相比，有效地提高了膽固醇7，8–脫氫酶Nvd-Bm的表達效率．本研究還構建了重組質粒pPIC9K-nvd-Bm，并通過電轉化方法，構建了含有pPIC9K-nvd-Bm的畢赤酵母GS115工程菌，SDSPAGE蛋白電泳分析表明，目標蛋白Nvd-Bm均已成功表達，但均主要存在于胞內．下一步工作可通過改造pPIC9K-nvd-Bm重組質粒信號肽序列引導目標蛋白高效胞外分泌，進一步提高其分泌表達量．此外，7，8–脫氫酶的基因組成目前尚不清晰，僅獲得其編碼基因表達蛋白，往往難以表現出酶活性．因此本課題組將進一步研究其與伴侶蛋白的共表達，為膽固醇7，8–脫氫酶的活性檢測奠定基礎．

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責任編輯：周建軍

Expression of the Protein Related to Cholesterol 7，8-Dehydrogenation

TANG Rui，SHEN Yanbing，GE Rile，NIU Dandan，WANG Min
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Bombyx moriNvd-Bm protein is associated with cholesterol 7，8-dehydrogenase. Based on DNA sequence encoded cholesterol 7，8-dehydrogenase reported on the NCBI(GenBank：AB232986.1)，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was cloned fromBombyx mori. Through codon optimization，cholesterol 7，8-dehydrogenase gene was obtained and the optimized gene was cloned into a yeast expression vector. Heterologously expressed target gene inP. pastorisGS115 resulted in the creation of engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains. Expression of the target protein in the engineeredP. pastorisGS115 / pPIC9K-nvd-Bm strains was demonstrated by SDS-PAGE. This study provided a foundation for the biological synthesis of 7-dehydrocholesterol.

Bombyx mori；cholesterol 7，8-dehydrogenase；codon optimization；Pichia pastoris；induced expression

Q812

A

1672-6510(2014)06-0027-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.006

2014–01–10；

2014–05–08

國家高技術研究發展計劃(863計劃)資助項目(2011AA02A211)

湯 睿（1989—），女，河北人，碩士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.