利用木糖母液生產堿性蛋白酶發酵工藝的初步研究

卜令軍，李 玉，路福平，王正祥

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

利用木糖母液生產堿性蛋白酶發酵工藝的初步研究

卜令軍，李 玉，路福平，王正祥

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

研究了以木糖工業化生產的副產物木糖母液為碳源，利用地衣芽孢桿菌工程菌(Bacillus licheniformis)TCCC11843發酵生產堿性蛋白酶的工藝．對搖瓶發酵工藝進行優化，確定了接種種齡為12,h，接種量為8%，培養基初始pH為6.5，發酵溫度為34,℃，在24,h一次補加4.0,mL 質量分數為50%木糖母液，此時的發酵液酶活力峰值為7,838,U/mL；在此基礎上，又在7,L發酵罐上實現了木糖母液的反饋補料，酶活力在80,h時達峰值，為14,912,U/mL．該結果為工業化生產堿性蛋白酶的發酵工藝優化提供了新的思路．

木糖母液；地衣芽孢桿菌；堿性蛋白酶；補料發酵

堿性蛋白酶是指水解蛋白質肽鍵的最適作用pH在堿性范圍的一類蛋白酶類，其最適作用pH一般為9～11[1–3]，在洗滌劑生產、食品加工、醫藥、皮革制造、絲綢制造、環境保護等行業[4–9]都有應用．目前，堿性蛋白酶發酵生產主要利用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)2709、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CW301、枯草芽孢桿菌CW302等菌株，以玉米粉、葡萄糖、蔗糖等作為碳源，這些碳源的利用勢必消耗大量糧食資源，增加堿性蛋白酶的生產成本，因此，開發營養全面、價格低廉的優質碳源具有重要的經濟效益和環境效益．

木糖母液是在木糖工業化生產中的副產物．在目前的木糖生產中，由于半纖維素水解液中尚存在葡萄糖等雜糖，濃縮糖液的黏度較大，影響了木糖的結晶得率；在分離出晶體木糖后的母液中，雜糖含量較高，即使再經過濃縮，也很難再使木糖結晶析出，從而產生大量的木糖母液[10–12]．木糖母液的主要成分為木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖等，價格大約只有2,000元/噸．如果能將木糖母液中的糖分充分利用起來，將帶來巨大的環境效益與經濟效益[13]．為降低生

產成本，汪東升等[14]對肺炎克雷伯氏菌利用木糖母液發酵生產2，3–丁二醇進行研究，并對發酵工藝進行優化，最終得到2，3–丁二醇質量濃度為35.7,g/L，比優化前提高了7.5,g/L，得率達到了理論得率的92%；周立國等[15]利用木糖母液生產的醬色素易溶于水、著色率高、紅色素達到5.5以上，對溫度、光照、pH耐受性強、穩定，十分適合調味品工業．木糖母液具有巨大的應用潛能，因此，本文選擇木糖母液為碳源，利用前期已構建成功的地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843生產堿性蛋白酶，并優化其發酵工藝，提高堿性蛋白酶酶活，以期為工業化生產奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)工程菌TCCC11843，保藏于天津科技大學生物工程學院酶與應用微生物研究室．

1.1.2 試劑

卡那霉素和L–酪氨酸，Sigma公司；干酪素，上海申翔化學試劑有限公司；福林試劑，北京索來寶科技有限公司；木糖母液，福田藥業；豆粕粉，市售；脫脂奶粉，完達山乳業有限公司；其他試劑均為分析純.

1.1.3 培養基

脫脂奶粉平板培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，脫脂奶粉10，瓊脂20，卡那霉素30,μg/mL，pH 7.0．

種子培養基(g/L)：牛肉粉1.50，酵母粉1.50，蛋白胨5.00，磷酸二氫鉀1.32，磷酸氫二鉀3.68，葡萄糖1.00，氯化鈉3.00，卡那霉素30,μg/mL，pH 7.0～7.2.

發酵培養基(g/L)：木糖母液40，豆粕粉45，硫酸銨5，氯化鈣0.2，氯化鈉0.63，磷酸氫二鈉1.0，磷酸二氫鈉0.65．

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵培養條件優化

采用單因素實驗，在250,mL三角瓶(40,mL裝液量)中分別考察種齡、初始pH、接種量和發酵溫度對產酶的影響．種齡分別選取8、10、12、14、16,h；發酵培養基初始pH分別選取5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；接種量分別選取2%、4%、6%、8%、10%；發酵溫度分別選取25、28、30、34、37、40,℃．

1.2.2 發酵實驗

利用發酵培養基、優化后的培養條件，在三角瓶中進行發酵實驗，每隔8,h取樣，測其酶活力和殘糖質量濃度．

1.2.3 補料量的確定

根據在發酵培養基中的產酶情況，在24,h分別向三角瓶中補加2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,mL質量分數為50%的木糖母液補料液，考察補料量對產酶的影響．

1.2.4 反饋補料發酵實驗

在7,L發酵罐(4,L裝液量)發酵過程中流加氨水，維持發酵液的pH為6.5．測定發酵液酶活力與殘糖質量濃度，根據殘糖質量濃度調整蠕動泵，改變補料速率，在發酵過程中維持殘糖質量濃度為13,g/L左右．當殘糖質量濃度小于11,g/L時，調大蠕動泵的流量以加大補料速率；當殘糖質量濃度大于15,g/L時，調小蠕動泵的流量以減小補料速率．

1.3 測定方法

1.3.1 堿性蛋白酶活力的測定

采用GB/T 23527—2009[16]方法，在40,℃條件下每分鐘水解酪蛋白產生1,μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位．

1.3.2 發酵液殘糖質量濃度測定

采用DNS法[17]測定殘糖質量濃度．

2 結果與討論

2.1 發酵培養條件的優化

2.1.1 種齡的確定

種齡對產酶的影響如圖1所示．當種齡為12,h時，堿性蛋白酶活力最高，因此確定種齡為12,h．

2.1.2 初始pH的確定

培養基初始pH對產酶的影響如圖2所示．初始pH為6.0～7.0時，有利于菌體產酶，初始pH為6.5時，堿性蛋白酶活力最高，當初始pH超過7.0時，酶活力開始下降．因此，確定培養基初始pH為

6.5．這一結果與黃文晶[18]、孫同毅等[19]在堿性蛋白酶的優化工藝中確定的pH為6.5～7.0一致，說明在此pH能夠穩定地維持菌體的生長與產酶．

2.1.3 接種量的確定

接種量對產酶的影響如圖3所示．當接種量為8%時，堿性蛋白酶活力最高，達到5,003,U/mL．因此，確定接種量為8%．當接種量過小時，菌體生長緩慢，發酵遲緩；接種量過大，則會因菌體生長過快而導致營養和氧氣缺乏，有些初級代謝產物或次級代謝產物的產生對酶合成有抑制作用．

2.1.4 發酵溫度的確定

發酵溫度對產酶的影響如圖4所示．

溫度從25,℃升高到34,℃時，堿性蛋白酶活力逐漸升高，增加趨勢明顯，34,℃時酶活力最大，溫度繼續升高，酶活力開始逐漸下降．因此，確定發酵溫度為34,℃．若溫度過低，菌體生長緩慢，會因菌體量少而影響酶的分泌；溫度過高，菌體代謝加快，指數期和穩定期會因此而縮短，使衰亡期提早出現．另外，在高溫下酶的熱穩定性差，易變性失活．

2.2 地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843在發酵培養基中的發酵進程

地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843在三角瓶中發酵進程如圖5所示．糖分在發酵初期緩慢消耗，8,h后質量濃度迅速下降，可能是菌體大量生長消耗了發酵液中的糖分；在24,h時的殘糖質量濃度下降為13.6,g/L，之后糖的消耗速率減慢．因此，確定24,h為補糖時間點．在前24,h發酵液中酶活力較低，隨后，發酵液中的酶活力迅速升高，至64,h時，酶活力達到峰值，為5,297,U/mL．

2.3 補料量對產酶的影響

根據木糖母液在發酵過程中的消耗情況，在24,h時向搖瓶中補加質量分數為50%的木糖母液補料液，補料量對產酶的影響如圖6所示．

在考察的補料量范圍內，補料量為4,mL時的酶活力峰值最大，為7,838,U/mL，相比于同一批次未補

加木糖母液時的酶活力峰值(5,137,U/mL)提高了52.5%．可以看出，選擇合適的補料時機和補料量，即在發酵液中的殘糖消耗殆盡時及時補加適量的木糖母液，能夠較好地維持菌體的生長與產酶，而又不會因糖濃度過高而對產酶產生抑制作用．

2.4 殘糖反饋補料發酵過程分析

殘糖反饋補料發酵結果如圖7所示．發酵液中的糖分在8,h內消耗緩慢，此時菌體處于延滯期，代謝速率緩慢；8,h后糖分的消耗速率開始加快，24,h時發酵液中糖分無法繼續消耗，開啟蠕動泵開始反饋補料，在24～48,h補料時間內，補入的糖被及時消耗，殘糖質量濃度未出現大的波動；在48,h時補料結束，此時殘糖質量濃度為13.1,g/L，殘糖幾乎消耗殆盡；發酵液酶活力24,h后開始迅速上升，在80,h時達到峰值，為14,912,U/mL．可見，殘糖反饋補料的方式消除了底物抑制作用對發酵過程的影響，且能更好地與菌體的生長、產酶條件相吻合，有利于提高酶活力．

3 結 語

本實驗以木糖母液為碳源、利用地衣芽孢桿菌工程菌TCCC11843發酵生產堿性蛋白酶，優化了發酵培養工藝：種齡12,h，初始pH,6.5，接種量8%，發酵溫度34,℃，24,h補加4.0,mL質量分數為50%的木糖母液．利用7,L發酵罐進行反饋補料實驗，酶活力在80,h時達最大值，為14,912,U/mL．雖然實驗結果與目前堿性蛋白酶的工業生產水平尚有一定差距，但木糖母液價格低廉，有一定的成本優勢，并且還可對其進行更大規模發酵實驗，進一步優化生產工藝，提高產酶水平．

［1］ Gupta R，Beg Q，Khan S，et al. An overview on fermentation downstream processing and properties of microbial alkaline proteases[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，60(4)：381–395.

［2］ Rao M B，Tanksale A M，Ghatge M S，et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998， 62(3)：597–635.

［3］ Deng A，Wu J，Zhang Y，et al. Purification and characterization of a surfactant-stable high-alkaline protease fromBacillussp. B001[J]. Bioresource Technology， 2010，101(18)：7100–7106.

［4］ Gupta R，Beg Q，Lorenz P. Bacterial alkaline proteases： Molecular approaches and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59(1)： 15–32.

［5］ Bhaskar N，Sudeepa E S，Rashmi H N，et al. Partial purification and characterization of protease ofBacillusproteolyticus-CFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities[J]. Bioresource Technology，2007，98(14)：2758–2764.

［6］ Sareen R，Mishra P. Purification and characterization of organic solvent stable protease fromBacillus licheni-formisRSP-09-37[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，79(3)：399–405.

［7］ Anwar A，Saleemuddin M. Alkaline proteases：A review[J]. Bioresource Technology，1998，64(3)：175– 183.

［8］ Maase F W J L，Van Tilburg R. The benefit of detergent enzymes under changing washing conditions[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society，1983，60(9)： 1672–1675.

［9］ Von der Osten C，Branner S，Hastrup S，et al. Protein engineering of subtilisins to improve stability in detergent formulations[J]. Journal of Biotechnology，1993，28 (1)：55–68.

［10］ 劉鵬先，肖力. 木糖的制備研究[J]. 華西藥學雜志，1995，10(3)：185–196.

［11］ 秦玉楠. 木糖的生產工藝及其效益[J]. 環境保護，1996(3)：24–26.

［12］ 萬成志. 玉米芯生產木糖的工藝技術[J]. 應用科技，1998(7)：12–13.［13］ 王玉萍. 木糖母液的綜合利用[D]. 重慶：重慶大學，2007.

［14］ 汪東升，張翠英，彭曉培，等. 木糖母液發酵生產2，3–丁二醇的研究[J]. 食品研究與開發，2012，33(7)：132–135.

［15］ 周立國，高俊杰. 木糖廢液制取醬色素方法及其產品的穩定性研究[J]. 現代化工，2001，21(4)：33–35，41.

［16］ 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB/T 23527—2009 蛋白酶制劑[S]. 北京：中國標準出版社，2009.

［17］ 王俊麗，聶國興，李素貞，等. DNS法測定還原糖含量時最適波長的確定[J]. 河南農業科學，2010，4(4)：115–118.

［18］ 黃文晶. 高產堿性蛋白酶重組菌及其發酵性能[D]. 無錫：江南大學，2012.

［19］ 孫同毅，殷向斌，郝繼興，等. 高活力堿性蛋白酶產生菌的選育與發酵放大[J]. 遼寧工程技術大學學報：自然科學版，2009，28(4)：679–682.

責任編輯：常濤

Alkaline Protease Fermentation Process Using Xylose Mother Liquor

BU Lingjun，LI Yu，LU Fuping，WANG Zhengxiang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

In this study，engineeredBacillus licheniformisTCCC11843,was used for the fermentation production of alkaline protease from a carbon source：xylose mother liquor，a by-product of xylose production. The optimized fermentation parameters of alkaline protease production were：inoculum culture age was 12,h，initial pH 6.5，inoculum volume 8%，fermentation temperature 34,℃，and feeding 4.0,mL 50% xylose mother liquor at the 24th,h. Under such optimal fermentation conditions，the maximum enzyme activity can reach 7,838,U/mL. Moreover，feedback feeding experiments using the 7,L fermenter resulted in the maximum enzyme activity of 14,912,U/mL at 80,h. These results are valuable for the optimal commercial production of alkaline protease.

xylose mother liquor；Bacillus licheniformis；alkaline protease；fed-batch fermentation

Q814.4

A

1672-6510(2014)06-0032-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.007

2014–05–04；

2014–07–01

國家高技術研究發展計劃“863計劃”資助項目(2011AA100905-4)；教育部長江學者和創新團隊發展計劃資助項目(IRT1166)

卜令軍（1988—），男，山東濟南人，碩士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.