磷酸肌酸鈉對大鼠肢體缺血再灌注心肌損傷的影響

袁夢　王丙瓊　丁明

[摘要] 目的 研究磷酸肌酸鈉對肢體缺血再灌注后心肌損傷有無保護作用及其機制。 方法 選取SD大鼠24只，將其隨機分為三組：①空白對照組（C組）；②肢體缺血再灌注組（LIR組）；③磷酸肌酸鈉組（P組），每組8只。分別檢測血清肌鈣蛋白I（c-TnI）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB），心肌組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、鈣調蛋白（CaM）的含量，并且觀察各組心肌組織的病理變化。 結果 LIR組與C組相比，血清c-TnI、CK-MB及心肌組織中MDA、CaM的含量都顯著增高，而SOD含量明顯下降，心肌組織有明顯的病理變化；P組與LIR組相比，SOD活性相對升高，c-TnI、CK-MB、MDA、CaM含量相對降低，病理變化有所改善。 結論 肢體缺血再灌注可誘發心肌組織的損傷；外源性磷酸肌酸鈉可減少肢體缺血再灌注心肌組織內氧自由基的產生，維持細胞內鈣平衡，起到保護心肌的作用。

[關鍵詞] 磷酸肌酸鈉；肢體缺血再灌注；心肌損傷；氧自由基

[中圖分類號] R-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）01-0001-03

臨床上的肢體創傷、斷肢再植、手術使用止血帶時間過長、血栓形成、擠壓綜合征等均可導致肢體缺血再灌注損傷。近年來對肢體缺血再灌注（limb ischemia reperfusion，LIR）的研究發現[1]，LIR不僅單純導致肢體的損傷，還可誘發心、肺、腦、肝、腎等遠隔器官的損傷，甚至可引發多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。LIR導致心臟損傷的機制現在研究表明主要是通過氧自由基、中性粒細胞（PMNs）介導的[2]。如何改善和避免LIR導致的損傷已經引起了人們的關注。磷酸肌酸鈉作為一種能量合劑，具有抗氧化、清除氧自由基、改善微循環等及維持細胞內鈣平衡的作用。本次實驗通過建立肢體缺血再灌注繼發心臟損傷的模型，探討外源性磷酸肌酸鈉對其的保護作用及其機制，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和分組

健康雄性SD大鼠24只，體重200～230 g，由濰坊醫學院動物中心提供，隨機分為三組：C組、LIR組、P組，每組8只。MDA、SOD、CaM試劑盒購于南京建成生物研究所。注射用磷酸肌酸鈉購自北京利祥制藥有限公司。

1.2 動物模型制備

大鼠術前12 h禁食，自由飲水。用10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉。用橡皮圈環扎大鼠雙后肢根部，阻斷大鼠雙下肢血流，環扎后雙下肢不能觸及動漫波動趾掌蒼白發涼。雙下肢環扎4 h后，剪斷橡皮圈，恢復血流灌注4 h，動脈搏動恢復，雙下肢逐漸變紅變暖，建模成功。P組于再灌注前5 min腹腔注射磷酸肌酸鈉（150 mg/kg）；LIR組再灌注前注射同等劑量的生理鹽水；而C組雙下肢不環扎只注射同等劑量的生理鹽水。

1.3 標本的采集及檢測

再灌注4 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，開腹于下腔靜脈取血3～5 mL，裝于促凝管，放置1 h凝固后3 000 r/min離心15 min，取上清液即血清，裝于EP管中冰箱-20℃保存；取血后迅速開胸，取出心臟。

1.4 觀察指標

①檢測血清中c-TnI、CK-MB的含量；②將心尖組織切下，生理鹽水沖洗干凈，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規切片，HE染色。光鏡下觀察心肌的病理變化。③去心肌組織400 mg，制成10%心肌組織勻漿，檢測心肌組織中MDA、SOD、CaM的含量，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.5 統計學處理

采用SPSS13.0統計學軟件對數據進行處理，所有數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清c-TnI、CK-MB含量

與C組相比，LIR組和P組血清c-TnI、CK-MB含量均增高（P < 0.01）；與LIR組比較，P組血清c-TnI、CK-MB含量則下降（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組心肌中MDA、SOD、CaM的變化

LIR組、P組分別與C組相比，MDA、CaM含量都升高，SOD活性降低（P < 0.05）；P組相較于LIR組，MDA、CaM含量降低，SOD活性增高（P < 0.05）。見表2。

表2 各組心肌中MDA、SOD、CaM含量的比較（x±s）

注：與C組比較，★P < 0.01，☆P < 0.05；與LIR組比較，○P < 0.05

2.3 心肌組織形態學變化

光鏡下觀察，C組可見大鼠心肌排列整齊，肌間隙未見炎性細胞浸潤；LIR組可見部分心肌纖維斷裂，肌間隙增寬，大量炎性細胞浸潤，毛細血管充血、擴張，肌間隙內有紅細胞漏出，心肌細胞腫脹，甚至可見心肌壞死；P組心肌的病理損傷有所改善，但未恢復正常。見封三圖1～3。

3 討論

缺血再灌注損傷是一個多因素參與、多機制損傷的過程，其中關鍵在于能量代謝障礙、鈣離子超載、氧自由基生成、白細胞的激活等方面[3]。而由肢體缺血再灌注導致的遠隔器官的損傷也越來越得到大家的重視。近年來研究[4-6]結果表明，LIR后心肌組織中MDA、髓過氧化物酶（MPO）、TNF-α、IL-10水平、Bax表達、凋亡指數（AI）明顯升高，SOD活性降低，左心室功能降低，證明了LIR可引起心肌的氧化應激反應、白細胞聚集、細胞凋亡等各方面的損傷。

MDA和SOD這對指標反映體內的氧化-抗氧化系統，間接反映了氧自由基產生的情況。MDA是氧自由基引發的脂質過氧化反應的終末代謝產物，其含量反映了體內脂質過氧化程度，間接反映了組織內自由基的水平。SOD是清除超氧陰離子Oˉ2的專一歧化酶，其活性變化可反映體內抗氧化功能的情況，是一種內源性保護機制，避免氧自由基的儲積。實驗結果表明，LIR使心肌組織中MDA含量顯著升高，SOD活性下降，說明肢體缺血再灌注后，氧在黃嘌呤氧化酶的作用下釋放大量氧自由基，引發心肌組織的脂質過氧化損傷，破壞心肌細胞膜的完整性，致使細胞的功能代謝發生障礙。c-TnI、CK-MB是心肌損傷的常用指標，廣泛應用于對心臟疾病的診斷中，特別是c-TnI具有診斷窗口寬，診斷閾值明確及檢測快速等優點，成為了判斷心肌損傷的金標準[7]。P組的情況有所改善，說明磷酸肌酸鈉可起到清除自由基、抗氧化的作用。endprint

鈣調蛋白（CaM，也稱鈣調素），是一種細胞內最重要的鈣受體蛋白，可參與調節生物體內多種Ca2+依賴的生理生化反應[8]。CaM通過與Ca2+特異性結合形成Ca2+-CaM復合物，調節Ca2+的跨膜轉運和肌漿網對Ca2+的攝取和釋放[9]。肢體缺血再灌注后導致心肌的氧化應激反應，使心肌細胞內Ca2+迅速增多，與CaM結合，使其活性升高，可直接激活由Ca2+-CaM調節的多種代謝酶，如一氧化氮合酶（NOS）、CaM依賴性蛋白激酶（CaMK）、磷酸二酯酶、腺苷酸環化酶（AC）等，這些酶均可引起心肌細胞的代謝障礙，進一步破壞細胞膜、線粒體等的功能，使細胞內Ca2+、組織內自由基進一步增多，形成心肌損傷的惡性循環。外源性磷酸肌酸鈉能被機體組織迅速吸收，直接釋放高能磷酸鍵，合成ATP，迅速補充機體能量，保護細胞結構、穩定細胞膜，增加缺氧組織對氧的利用，減輕缺氧組織的損傷[10]。本實驗研究結果表明，LIR組大鼠心肌組織內CaM含量明顯升高，而P組相對減少，說明給予外源性磷酸肌酸鈉后，為心肌細胞提供ATP，穩定了細胞膜，減少了Ca2+細胞內流，改善了心肌細胞代謝障礙，減輕了心肌組織的病理損傷。

綜上所述，LIR可導致機體內的自由基大量產生、白細胞大量激活“呼吸爆發”，誘發遠隔器官心臟的損傷；再灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉，可改善LIR誘發的心肌損傷，可能的機制是磷酸肌酸鈉可為心肌細胞提供能量，為心肌細胞膜上的Ca2+交換泵提供ATP，減少Ca2+內流，降低CaM的活性，維持細胞內Ca2+平衡，從而起到減少自由基生成、抗氧化、防止鈣超載、改善微循環等藥理作用。臨床上對肢體缺血再灌注導致心肌損傷的程度及應用磷酸肌酸鈉的意義還有待證實。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-09-10）endprint

鈣調蛋白（CaM，也稱鈣調素），是一種細胞內最重要的鈣受體蛋白，可參與調節生物體內多種Ca2+依賴的生理生化反應[8]。CaM通過與Ca2+特異性結合形成Ca2+-CaM復合物，調節Ca2+的跨膜轉運和肌漿網對Ca2+的攝取和釋放[9]。肢體缺血再灌注后導致心肌的氧化應激反應，使心肌細胞內Ca2+迅速增多，與CaM結合，使其活性升高，可直接激活由Ca2+-CaM調節的多種代謝酶，如一氧化氮合酶（NOS）、CaM依賴性蛋白激酶（CaMK）、磷酸二酯酶、腺苷酸環化酶（AC）等，這些酶均可引起心肌細胞的代謝障礙，進一步破壞細胞膜、線粒體等的功能，使細胞內Ca2+、組織內自由基進一步增多，形成心肌損傷的惡性循環。外源性磷酸肌酸鈉能被機體組織迅速吸收，直接釋放高能磷酸鍵，合成ATP，迅速補充機體能量，保護細胞結構、穩定細胞膜，增加缺氧組織對氧的利用，減輕缺氧組織的損傷[10]。本實驗研究結果表明，LIR組大鼠心肌組織內CaM含量明顯升高，而P組相對減少，說明給予外源性磷酸肌酸鈉后，為心肌細胞提供ATP，穩定了細胞膜，減少了Ca2+細胞內流，改善了心肌細胞代謝障礙，減輕了心肌組織的病理損傷。

綜上所述，LIR可導致機體內的自由基大量產生、白細胞大量激活“呼吸爆發”，誘發遠隔器官心臟的損傷；再灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉，可改善LIR誘發的心肌損傷，可能的機制是磷酸肌酸鈉可為心肌細胞提供能量，為心肌細胞膜上的Ca2+交換泵提供ATP，減少Ca2+內流，降低CaM的活性，維持細胞內Ca2+平衡，從而起到減少自由基生成、抗氧化、防止鈣超載、改善微循環等藥理作用。臨床上對肢體缺血再灌注導致心肌損傷的程度及應用磷酸肌酸鈉的意義還有待證實。

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綜上所述，LIR可導致機體內的自由基大量產生、白細胞大量激活“呼吸爆發”，誘發遠隔器官心臟的損傷；再灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉，可改善LIR誘發的心肌損傷，可能的機制是磷酸肌酸鈉可為心肌細胞提供能量，為心肌細胞膜上的Ca2+交換泵提供ATP，減少Ca2+內流，降低CaM的活性，維持細胞內Ca2+平衡，從而起到減少自由基生成、抗氧化、防止鈣超載、改善微循環等藥理作用。臨床上對肢體缺血再灌注導致心肌損傷的程度及應用磷酸肌酸鈉的意義還有待證實。

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