茴香成熟葉柄石蠟切片技術的研究

陳土娟，黃子娟，潘海玉，陳佳敏，王 瓊，郭克婷，潘春香

茴香成熟葉柄石蠟切片技術的研究

陳土娟，黃子娟，潘海玉，陳佳敏，王 瓊，郭克婷，潘春香*

（韶關學院英東農業科學與工程學院，廣東韶關512005）

石蠟切片技術是一項基礎的實驗技術，在具體操作過程中仍經常在的裂紋、皺縮、不粘片、脫落、薄厚不勻等問題.且不同作物，同一種作物不同器官，同一器官不同發育階段，每一環節所采取的方法不同，在實際操作工程中均不能照搬實驗指導或者文獻，而需要進行反復摸索才可以制得一個理想的片子.實驗以小茴香成熟葉柄為材料，通過大量的摸索性試驗，成功制得了小茴香成熟葉柄的永久性石蠟片子，明確了葉柄的內部組織構造，提出了取材與固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、染色、切片、粘片等關鍵環節的適宜操作方法，提高了制片效率和成功率，為利用石蠟切片技術進行科研和教學的工作人員提供參考.

茴香；成熟葉柄；石蠟切片

石蠟切片技術因其具有經濟、方便、適用、簡便、易操作、設備要求不高、可長期保存等優點而在組織學和病理學常規制片技術中成為最為廣泛的應用.它在植物的科學技術研究領域扮演著十分重要的角色.但是，在石蠟切片制作仍然存在切片不成帶、彎曲、出現裂紋、皺縮、不粘片、脫落、薄厚不勻等諸多問題，且不同作物，同一種作物不同器官，同一器官不同發育階段，每一環節所采取的方法不同，在實際操作工程中均不能照搬實驗指導或者文獻，而需要進行反復摸索才可以制得一個理想的片子.因此，針對石蠟存在的問題，有過很多探討和改良.有針對不同植物的研究，如玉米成熟期莖稈［1］、水稻籽粒胚乳［2］、大豆莖頂端分生組織［3］、蕨類植物［4］、白頭翁花［5］、杏花芽［6］、樺樹松蘿［7］、粳稻穎果［8］、含羞草［9］等.也有針對石蠟切片技術改良進行研究的，如候春春經過總結和自己實踐提出了試驗藥劑、時間和溫度是三大關鍵因素［10］；楊捷頻提出了一些能縮短實驗周期，解決實驗有毒物質二甲苯污染的方案［11］；從載玻片、蓋玻片的處理，浸蠟與包埋，染色液的配制，展片、粘片、烘片進行了探索，提出了染色效果好、組織不脫落的關鍵技術［12］；江虹針對切片不成帶、切片彎曲、切片裂紋、厚薄不勻、皺縮、粘刀、脫落、灰染、著色不勻、褪色、封固不良等問題進行了探索，并提出了解決措施［13］；趙俊對石蠟的精煉、取材與固定、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、展片、粘片、脫蠟復水及染色、中性樹膠封藏幾個方面探討了植物石蠟切片技術［14］.本文以內蒙古小茴香葉柄為材料，對其石蠟切片技術的取材、固定、洗滌、脫水、包埋、切片、粘片、脫蠟、染色、脫水、透明和封膠等一系列環節進行了試驗和總結，提出了取材與固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、染色、切片、粘片等關鍵環節的適宜方法，以提高制片效率和成功率，為石蠟切片技術在植物解剖學上的應用提供參考.

1 材料與方法

1.1實驗材料

選擇內蒙古小茴香葉柄為材料，切成大約長度3～5 mm莖段，立即放入FAA固定液中固定，抽氣后放置4℃冰箱貯存.

1.2 試驗方法

小茴香于2013年3月播種于韶關學院英東農業科學與工程學院C座樓頂大棚花盆中，取成熟的葉柄作為材料.切片在韶關學院英東農業科學與工程學院植物學實驗室進行.實驗在傳統的石蠟包埋技術的基礎上，根據小茴香成熟葉柄的結構特點，對脫水、透明、透蠟、包埋、染色、切片、粘片、脫蠟、封片等步驟進行了改進.實驗用德國徠卡半薄切片機切片，德國萊卡LEICA DM LS2顯微鏡觀察，Nikon COOLPIX4500數碼相機進行顯微成像.

（1）取材與固定：材料在低溫的條件下(保溫材料的盒子里面裝冰塊)取，且迅速固定.分割材料要快、準，分割長度為3～5 mm.固定用醫用青霉素小瓶，每個小瓶中放置3～4段材料，固定24 h.

（2）脫水與透明：脫水與透明，時間是關鍵，而且脫水與透明二者密切相關.脫水越充分，透明所需的時間就越短.實驗采取脫水透明均為1.5 h.

（3）染色：染色在1/2純酒精+1/2純二甲苯透明時間加入效果最好.染色劑量以1～2滴為宜.

（4）包埋：石蠟選擇與精煉石蠟質地是石蠟切片中最為關鍵的一步.以54～56，熔點53～57規格的石蠟包埋效果好.煮蠟用75℃恒溫水浴進行多次熔蠟換杯.豎立材料包埋中豎立材料的過程也是比較難的一步.采用制冷臺方法.具體為：先將兩條玻璃（當成致冷臺）放到涼水中浸涼備用，然后將蠟杯中的組織與蠟液全部倒入紙船，擺好材料的位置，再將紙船放到浸過涼水的玻璃塊上，迅速將已經擺好的材料豎立起來.

（5）切片、粘片與脫蠟：夏天高溫季節切片之前，先將蠟塊放入冰箱中冰凍一會，保持石蠟的硬度；當室內干燥時，在旁邊放一盆溫水增加室內濕度.粘片采用撈片法.即：將切好的片子放到40℃左右的溫水上，使切片展開，然后用載玻片將蠟片撈起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.撈片法會帶有許多水分，一般需要烘1 h以上或更長時間.脫蠟的時間長短與氣溫有關.夏天高溫時，時間可以短一點，每一步驟3～5 min；冬季低溫時，可延長時間，或提高室溫.

（6）溶液換置與封片：脫蠟、染色、脫水透明過程所用的溶液在重復用過3～4遍后，要更換溶液.通常二甲苯里進入水分后，二甲苯溶液會出現白色渾濁或水珠狀的懸浮物，因此，二甲苯溶液需要更換.封片要濕封.即先將膠液滴在組織的邊緣位置，然后將蓋玻片傾斜蓋在膠液上，再緩慢將膠液輕輕壓至組織上，讓其自然風干.

2 結果與分析

2.1茴香葉柄石蠟包埋制片方法

針對茴香葉柄結構特點及石蠟包埋制片方法中存在的問題，通過大量摸索性試驗，得到了適合茴香成熟葉柄的石蠟切片方法，同傳統石蠟切片法相比，在固定、石蠟選擇、石蠟精煉、脫水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脫蠟、封片等方面進行了改進，提高了制片效率.

（1）脫水與透明.明確了脫水時間與透明時間的相關性，即脫水時間越長，透明時間就越短，本實驗脫水2 h，透明為1.5 h.

（2）染色.傳統染色方法是在70%酒精脫水時加入染色劑.但實際操作過程中，即使是放置一個晚上，已染色的材料也會在后續逐級高濃度的酒精中被沖洗掉，最后幾乎全部脫色.本實驗摸索出在1/2純酒精+ 1/2純二甲苯透明時間加入染色劑效果最好.

（3）石蠟選擇與精煉.實驗對比了規格52～54，熔點51～55和規格54～56，熔點53～57兩種石蠟的包埋效果，篩選出規格54～56，熔點53～57規格的效果較好.煮蠟用75℃恒溫水浴進行多次熔蠟換杯為宜.

（4）豎立材料.豎立材料使石蠟切片中難以操作的一步.通常采用冷水中放置紙船的方法，但在實際操作過程中存在難以豎立、組織與石蠟分離等現象.本實驗采用的制冷臺方法，效果很好.

（5）切片、粘片和脫蠟切片與室內溫度密切相關.夏天操作時容易出現組織壓縮，切片皺褶不易展開之現象.本實驗摸索出夏天高溫季節切片之前，先將蠟塊放入冰箱中冰凍一會，保持石蠟的硬度；同時，當夏季室內干燥，蠟片受靜電影響卷片，不能形成連片時，在旁邊放一盆溫水增加室內濕度可一切出較好的片子.傳統方法是用加熱展開的方法，即在粘片時，滴一滴蒸餾水在載玻片上，再取切片，浮置水面上，然后置烘片臺上，使切片展開燙平，材料不現皺紋為度.最后將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時以記號筆在玻片上編號，放入30～40℃溫箱中約24 h烘干.

本研究的改良方法為撈片法，即用將切好的片子放到40℃左右的溫水上，使切片展開，然后用載玻片將蠟片撈起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.撈片法會帶有許多水分，一般需要烘1 h以上或更長時間.脫蠟的時間長短與氣溫有關.夏天高溫時，時間可以短一點，每一步驟3～5 min；氣溫較低的冬天時，要延長時間，甚至提高室溫，否則蠟不容易被脫去，從而影響后續的步驟.

（6）溶液換置和封片.一般脫蠟、染色、脫水透明過程所用的溶液在重復用過3～4遍后，就要更換溶液.如果有水分進入二甲苯，二甲苯溶液就會出現白色渾濁甚至出現水珠狀的懸浮物質，經過染色的載玻片逐級放入其他溶液缸中的時候，也會導致其他缸中的溶液變色.一般，觀察其顏色變化的深淺來斷定是否該換其溶液.

通常封片前切片在空氣中放置時間太長，二甲苯揮發，不僅使封片劑難以進入組織間隙，而且切片中易出現類似色素樣的點狀結晶和像核一樣的黑色圓斑.封片用的是中性樹膠.我們摸索出的方法為：濕封.即先將膠液滴在組織的邊緣位置，然后將清洗干凈的蓋玻片的傾斜蓋在膠液上，再緩慢地將膠液輕輕壓至組織上，最好選用稀一點的膠液.封好片貼上標簽，讓其自然風干.

2.2小茴香葉柄石蠟包埋制片效果

小茴香葉柄的石蠟包埋切片組織完整、清晰、染色均勻，如圖1所示.葉柄是葉片與莖的連接部分，主要起輸導和支持作用.葉柄具有與莖相連的維管束，是葉片與莖之間的物質運輸的通道.葉柄由外到內由表皮、厚壁細胞、皮層、維管束、髓腔組成.表皮細胞近似長方形，排列緊密.厚壁細胞是具有由初生壁和次生壁組成的細胞.維管束形成中可見初生韌皮部，初生木質部，初生木質部10束，呈發散型分布.初生木質部的外面是初生韌皮部.葉柄中間髓部為空腔，被周圍薄壁細胞圍繞，沿著維管束延伸，形成葉柄內的氣道.

圖1 小茴香葉柄橫切面圖

3 討論

關于小茴香植物組織構造方面的研究報道較少.潘春香等研究了內蒙古茴香與“油茴1號”茴香根、莖的解剖結構，該研究重點揭示了2個品種根、莖的基本組織結構及其區別，而未總結和提出其相關的石蠟包埋技術的具體改進［15］.本實驗在對葉柄基本組織構造進行觀察的同時，重點研究總結了成熟葉柄的石蠟包埋技術.

小茴香葉柄由外到內由表皮、厚壁細胞、皮層、維管束、髓腔組成.表皮細胞近似長方形，排列緊密.厚壁細胞是具有由初生壁和次生壁組成的細胞.維管束由初生韌皮部和初生木質部組成，有10束，呈發散型分布.初生木質部的外面是初生韌皮部.葉柄中間髓部為空腔，被周圍薄壁細胞圍繞，沿著維管束延伸，形成葉柄內的氣道.外層細胞排列致密、木質化程度高、內部細胞疏松、組織較軟.針對成熟期小茴香成熟葉柄的結構特性，在傳統石蠟包埋的基礎上，在固定、石蠟選擇、石蠟精煉、脫水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脫蠟、封片等方面進行了改進，提高了制片效率.

具體改進方法為：脫水2 h、透明1.5 h；染色是在1/2純酒精+1/2純二甲苯透明時間加入染色劑；石蠟選擇規格為54～56，熔點53～57的；煮蠟用75℃恒溫水浴進行多次熔蠟換杯為宜；豎立材料制冷臺方法，即先將兩條玻璃（當成致冷臺）放到涼水中浸涼備用，然后將蠟杯中的組織與蠟液全部倒入紙船，擺好材料的位置，再將紙船放到浸過涼水的玻璃塊上，迅速將已經擺好的材料豎立起來；切片在夏天高溫季節切片之前，先將蠟塊放入冰箱中冰凍一會，保持石蠟的硬度；同時，當室內干燥時，在旁邊放一盆溫水增加室內濕度；粘片為撈片法，即用將切好的片子放到40℃左右的溫水上，使切片展開，然后用載玻片將蠟片撈起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.撈片法會帶有許多水分，一般需要烘1 h以上或更長時間；脫蠟的時間長短與氣溫有關.夏天高溫時，時間可以短一點，每一步驟3～5 min；氣溫較低的冬天時，要延長時間，甚至提高室溫，否則蠟不容易被脫去，從而影響后續的步驟；溶液換置一般脫蠟、染色、脫水透明過程所用的溶液在重復用過3～4遍后，就要更換溶液.如果有水分進入二甲苯，二甲苯溶液就會出現白色渾濁甚至出現水珠狀的懸浮物質，經過染色的載玻片逐級放入其他溶液缸中的時候，也會導致其他缸中的溶液變色.一般，觀察其顏色變化的深淺來斷定是否該換其溶液；封片為濕封.即先將膠液滴在組織的邊緣位置，然后將清洗干凈的蓋玻片的傾斜蓋在膠液上，再緩慢地將膠液輕輕壓至組織上，最好選用稀一點的膠液.封好片貼上標簽，讓其自然風干.

石蠟切片技術簡單易行，但要想切出一個好的片子卻絕非易事，需要針對具體材料、藥劑、設備、操作環境等情況進行長時間的摸索和總結.希望本研究能為石蠟切片技術操作者提供參考.

［1］李素坤，張秋芝，郝玉蘭，等.玉米成熟期莖稈石蠟切片方法的研究［J］.安徽農業科學，2010，38(8):3935-3937.

［2］康海岐，常紅葉，許育彬，等.水稻籽粒胚乳的石蠟切片方法改良及其結構發育觀察［J］.北植物學報，2008，28(5):1069-1074.

［3］李曉梅.大豆莖頂端分生組織石蠟切片的制備［J］.大豆科學，2008，28(4):708-710.

［4］吳華，陳娉婷，袁玲，等.蕨類植物石蠟切片制作技術探討［J］.湖北農業科學，2011，50(18):3767-3769，3774.

［5］王金平，張俊梅.白頭翁花的石蠟切片制作［J］.信陽師范學院學報:自然科學版，2008，21(4):573-576.

［6］帥煥麗，楊途熙，魏安智，等.杏花芽石蠟切片方法的改良［J］.果樹學報，2011，28(3):536-539.

［7］蘇印泉，彭鋒，黎斌，等.樺樹松蘿的石蠟切片方法改良及形態學研究［J］.西北植物學報，2007，27(5):859-863.

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［9］趙云，李濤，陳增潔.含羞草石蠟切片的制作［J］.寧夏農林科技，2011，52(4):45-46.

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［12］廖秋萍，石長青，饒麗娟.石蠟切片制片技術的探討［J］.塔里木大學學報，2006，18(1):69-71.

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［14］趙俊，木萬福，張志星.植物石蠟切片技術改進［J］.安徽農學通報，2009，15(5):69，90.

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Research on plant paraffin section technology on mature petioles of fennel

CHEN Tu-juan，HUANG Zi-juan，PAN Hai-yu，CHEN Jia-min，WANG Qong，GUO Ke-ting，PAN Chun-xiang*
(Yingdong College of Agricultural Science and Engineering,Shaoguan University，Shaoguan 512005,Guangdong，China)

Paraffin section technology is the most basic experimental technology，but problems of cracking，shrinking，non-sticking to slides，exfoliation and uneven thickness still exist in the process of operation. Meanwhile，the methods are differently used on different plants，different organs of same plant and different growth stage of same organ，so it is unreasonable to copy the methods listed in experiment guidance or reference.An ideal slide only can be obtained through trial and error.This experiment applies the mature petioles of fennel as experimental material，and through this experiment it successfully obtain the permanent paraffin slide of fennel’s mature petioles through trial and error and make clear the internal organizations and structures of the petioles.Additionally，it also figured out some appropriate operating methods in some key procedures，such as sampling and fix，dehydration and verification，paraffin and embedding，staining，section，sticking and so on.These methods effectively improve the efficiency of making slides and provide references for staff to do scientific research and teach by making use of the paraffin section technology.

fennel;mature petioles;paraffin section

G945.79

A

1007-5348（2014）12-0041-05

（責任編輯：邵曉軍）

2014-05-18

國家自然科學基金項目（31070287）；國家級大學生創新創業訓練計劃建設項目（201310576-003）.

陳土娟（1989-），女，廣東湛江人，韶關學院英東農業科學與工程學院學生，主要從事芳香植物栽培與生理方面的研究.*通訊作者.