微波預處理-超聲波提取山茱萸多糖及穩定性研究

史娟

（陜西理工學院化學與環境科學學院，陜西漢中723000）

近年來，隨著分子生物學、生物化學等學科的發展，多糖所具有的增強免疫功能，抗輻射、抗腫瘤、抗炎、降血糖等生物活性，逐漸被人們發現和認識，成為當前新藥發展的方向之一。山茱萸（Fructus corni）作為山茱萸科植物山茱萸的干燥果實，因其抗氧化作用[1]、抗癌、抗腫瘤作用[2-3]、抗衰老作用[4]及保護腦組織等作用[5]而成為生物醫藥研究、開發的一大熱點。目前，山茱萸多糖的提取技術主要包括熱水提取法[6]、堿提取法[7]、超聲波提取法[8]、微波提取法[9]和酶提取法[10]。其中，超聲波、微波提取法因其速度快、能耗小、溶劑用量小等特點受到青睞。目前，關于微波、超聲波技術聯合用于山茱萸多糖的提取及穩定性的研究報道尚未見到。本文將微波、超聲波技術聯合應用于山茱萸多糖的提取，并對提取多糖進行穩定性研究。以期獲得山茱萸多糖的最佳提取條件及穩定性數據，為其產業化生產及深加工提供有效方法及技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

山茱萸2011年10月下旬收于漢中佛坪縣，洗凈、烘干、粉碎后，經乙醚、乙醇回流脫脂脫色后密封備用。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乙醚、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、濃硫酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鋁、氯化鈣、氯化銅、氯化鐵、檸檬酸、苯甲酸鈉、30%H2O2、亞硫酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為國產分析純。水為二次去離子水。

1.1.3 儀器

101 型電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；FW117 粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AL204-IC 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；WP700 型微波爐：佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司；SB-5200DT 超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；HH 系列恒溫水浴鍋：河北省黃驊市渤海電器廠；TDL-5 臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；721 型可見分光光度計：山海光譜儀器有限公司制造；RE-52B 型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；PHS-3S 型pH 酸度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山茱萸多糖提取方法

山茱萸果實→烘干→粉碎→乙醚、乙醇回流脫脂脫色→微波預處理→超聲波提取→蒸發濃縮→乙醇沉淀過夜→Savage 法除蛋白→二次醇沉→靜置過夜→無水乙醇洗滌→低溫干燥→山茱萸多糖。

1.2.2 標準曲線的繪制

準確吸取1 mg/mL 的標準葡萄糖溶液2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0、28.0 mL 于100 mL 容量瓶中，蒸餾水定容；再分別吸取上述各溶液1.0 mL 于25 mL比色管中，加入1.0 mL 2%苯酚和5.0 mL 濃硫酸；搖勻，沸水浴加熱15 min 后，冰水浴中冷至室溫，以蒸餾水為空白，在波長490 nm 處測吸光度，繪制標準曲線如圖1 所示。

圖1 標準曲線Fig.1 The standard curve of polysaccharide

1.2.3 山茱萸中多糖含量的測定方法

苯酚-硫酸比色法測定山茱萸多糖含量[11]，多糖提取率計算采用：多糖提取率＝（C×V）/W×100%，式中C 為按標準曲線得出的多糖溶液濃度；V 為多糖溶液體積；W 為原料質量。

1.2.4 提取實驗

采用不同超聲時間、溫度、料液比及醇沉濃度4個因素對山茱萸多糖提取率的影響進行單因素考查。并結合單因素實驗結果設計L9（34）的正交試驗（見表1），尋求最佳提取工藝條件。

表1 四因素三水平正交試驗表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 山茱萸多糖的穩定性試驗

取山茱萸多糖溶液，通過改變酸堿度、加入不同金屬離子、食品添加劑、氧化還原劑等的水溶液，在一定條件下放置一段時間，在波長為490 nm 處測定不同溶液的吸光度，考察山茱萸多糖在上述條件下的穩定性。

2 結果與討論

2.1 最佳單因素的確定

2.1.1 超聲提取時間對多糖提取率的影響

準確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預處理60 s，在料液比1 ∶14（g ∶mL）、提取溫度60 ℃的條件下，改變超聲處理時間，研究多糖提取率。超聲提取時間對多糖提取率的影響如圖2 所示。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of time on polysaccharide yield

結果表明，隨著超聲提取時間的增加，山茱萸多糖得率逐漸提高。在80 min 時，多糖得率達到最高。此后隨著處理時間的延長，多糖得率開始下降。故最佳超聲提取時間為80 min。

2.1.2 超聲提取溫度對多糖提取率的影響

準確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預處理60 s 后，在料液比1 ∶14（g ∶mL）、超聲提取時間80 min 的條件下，改變超聲處理溫度，研究多糖提取率。溫度對提取率的影響見圖3，隨著提取溫度升高，多糖得率隨之增加，在60 ℃多糖得率最高。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide yield

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響

準確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預處理60 s 后，在超聲處理時間80 min，溫度60 ℃的條件下，研究料液比對山茱萸多糖提取效果的影響見圖4。

圖4 料液比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on polysaccharide yield

圖4 反映出了料液比對多糖提取率的影響，料液比低于1∶14（g/mL）時，增大料液比，多糖提取率隨之增加；料液比大于1∶14（g/mL）后，提取率減小。這是因為溶劑用量少，原料細胞組織浸潤不完全，提取效果差；而過多溶劑則會消耗大量超聲波輻射能量，因而影響多糖的析出。因此，選擇料液比1∶14（g/mL）為宜。

2.1.4 醇沉濃度對多糖提取率的影響

準確稱取5 g 脫脂脫色后的山茱萸粉末，微波預處理60 s 后，在超聲處理時間80 min，提取溫度60 ℃，料液比為1∶14（g/mL）條件下，改變醇沉濃度，研究多糖提取率。醇沉濃度對提取率的影響見圖5。結果表明，隨著乙醇濃度升高，多糖得率隨之增加，在乙醇濃度75%時，多糖得率最高。

圖5 醇沉濃度對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of alcohol concentration on polysaccharide yield

2.2 正交試驗得出各因素交互作用對山茱萸多糖提取含量的影響

2.2.1 正交試驗結果與分析

正交試驗結果與分析見表2、表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

正交試驗分析由表2 可知，在山茱萸多糖超聲提取的因素中：時間A＞溫度B＞醇沉濃度D＞料液比C，優方案為A2B2C2D1，故最佳提取條件為：提取時間80 min，提取溫度60 ℃，料液比1 ∶14（g/mL），乙醇濃度為65 %。方差分析各因素與極差分析結果是一致，說明本實驗設計方法合理，操作符合規范。

2.2.2 驗證性試驗結果

為進一步確定山茱萸多糖微波預處理-超聲波提取的最佳工藝條件，在正交試驗基礎上選擇最優水平組合：A2B2C2D1，并在此條件下提取山茱萸多糖，平行3 次，多糖提取率平均值為16.83%。

2.3 山茱萸多糖的穩定性研究

2.3.1 金屬離子對山茱萸多糖的影響

取4 mL 的多糖溶液6 份，分別加入0.05 mol/L 的KCl、NaCl、CaCl2、AlCl3、FeCl3、CuCl2溶液2 mL，搖勻避光靜置2h，用苯酚-硫酸比色法測其吸光度結果見圖6。

圖6 金屬離子對多糖穩定性的影響Fig.6 Influence of metal ions on polysaccharide stability

由圖6 可以看出，幾種金屬離子對多糖穩定性的影響。K+、Ca2+、Na+離子使多糖吸光度明顯下降，Fe3+、Cu2+使吸光度大幅上升，僅有Al3+對吸光度影響不大。說明山茱萸多糖在此條件下可能與K+、Ca2+、Na+、Fe3+、Cu2+發生了化學反應。

2.3.2 pH 對山茱萸多糖的影響

取4mL 的多糖溶液6 份，用0.1mol/LHCl和0.1mol/L NaOH 調節pH 為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，避光處理2 h，用苯酚-硫酸比色法測其吸光度。由圖7 可知pH 對山茱萸多糖穩定性的影響，在酸性條件下，多糖的吸光度變化較小；而堿性條件下，多糖的吸光度隨著pH 先增后減。由此表明，山茱萸多糖在酸性介質中比較穩定，在堿性介質穩定性較差。

圖7 pH 對多糖穩定性的影響Fig.7 Influence of pH value on polysaccharide stability

2.3.3 食品添加劑對山茱萸多糖的影響

取4 mL 的多糖溶液3 份，分別加入0.05 mol/L 的VC、檸檬酸、苯甲酸鈉2.0 mL，保溫2 h，用苯酚-硫酸比色法測其吸光度。食品添加劑對山茱萸多糖穩定性的影響見表4。

表4 食品添加劑對多糖穩定性的影響Table 4 Influence of food additives on polysaccharide stability

實驗結果表明，苯甲酸鈉的加入對多糖的影響不大，檸檬酸、VC的加入導致吸光度明顯增加，說明這兩種物質對山茱萸多糖的影響較大。

2.3.4 氧化還原劑對西洋參葉多糖的影響

取4 mL 的多糖溶液10 份，分別加入濃度為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L 的H2O2和Na2SO3溶液 各2.0 mL，振蕩避光保存2 h，用苯酚-硫酸比色法測定吸光度。氧化還原劑對山茱萸多糖穩定性的影響見圖8。

圖8 氧化還原劑對多糖穩定性的影響Fig.8 Influence of oxidant and reductant on polysaccharide stability

由圖8 可知，多糖吸光度值隨著氧化還原劑濃度的增大，逐漸降低，說明山茱萸多糖在氧化還原劑中的穩定性較差。

3 結論

本實驗用微波預處理-超聲波法從山茱萸中提取多糖，其最優化工藝條件：超聲時間80 min、溫度60 ℃、料液比1∶14（g/mL），乙醇濃度65%，此工藝下得到的山茱萸多糖提取率為16.83%。與常見的熱水提取法[6]、微波提取法和酶提取法[10-11]相比，該法產率高、方法簡便、節能環保。山茱萸多糖在Al3+、苯甲酸鈉及弱酸性溶液中穩定性較好；而在K+、Ca2+、Na+、Fe3+、Cu2+、檸檬酸鈉、VC、氧化還原劑中穩定性較差。因此在綜合開發利用山茱萸多糖產品時應注意避免與影響其穩定性的物質直接接觸。

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