發酵辣椒中產亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌L5的選育及特性研究

王蘭，趙玲艷，陳思思，王雪艷，游靜，鄧放明*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.常德市鼎城區質量技術監督局，湖南常德415100）

發酵辣椒中產亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌L5的選育及特性研究

王蘭1，趙玲艷1，陳思思1，王雪艷1，游靜2，鄧放明1*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.常德市鼎城區質量技術監督局，湖南常德415100）

以傳統發酵辣椒為分離源，從中分離出10株可降解亞硝酸鹽的乳酸菌，經過復篩得到一株產亞硝酸鹽還原酶能力最強的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）L5，并通過單因素及正交試驗對其降解特性進行了研究。結果表明：L5對亞硝酸鹽有明顯的降解作用，在正常培養條件下，發酵36 h，L5對亞硝酸鹽的降解率為56.25%；在維持pH 6.0以上，消除酸對亞硝酸鹽降解作用的條件下，發酵36 h，L5對亞硝酸鹽的降解率為66.42%，主要為產酶降解。L5降解亞硝酸鹽的最佳條件為溫度34℃，時間30 h，底物質量濃度120 mg/L，食鹽含量6%，此時，L5對亞硝酸鹽的降解率可達82.84%。

發酵辣椒；亞硝酸鹽；亞硝酸鹽還原酶；短乳桿菌L5；特性

傳統發酵辣椒主要是依靠天然附著在其表面的乳酸菌進行乳酸發酵完成的，但發酵過程中不可避免的會產生亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是潛在的致癌物質，可與食品中蛋白質分解中間產物仲胺在酸性條件下轉化成亞硝胺，此物質具有強烈的致癌性，可誘發肝癌、胃癌、食道癌和咽癌等多種癌癥[1-2]。傳統腌泡菜、各種肉灌腸中也都存在亞硝酸鹽超標的問題[3]。因此，如何降低亞硝酸鹽的含量成為了食品研究人員關注的熱點問題。目前，降解亞硝酸鹽的方法主要有化學法和生物法[4]，其中生物法是研究的重點，主要是利用可降解亞硝酸鹽的微生物[5]或其產生的亞硝酸鹽還原酶[6]，來降低亞硝酸鹽的含量。閆金星等[7]從東北朝鮮族咸菜中分離出6株降解亞硝酸鹽能力較強的乳酸菌株，其中4株為植物乳桿菌，2株為明珠片球菌。張慶芳等[8]分析了乳酸菌降解肉制品中亞硝酸鹽的機理，發現乳酸菌降解亞硝酸鹽分為兩部分，在pH＞4.5的發酵前期主要以酶降解為主；在pH＜4.0的發酵后期，主要以酸降解為主。龔鋼明團隊成功地從發酵食品中分離出了產亞硝酸鹽還原酶的乳酸菌，并對其編碼亞硝酸鹽還原酶的基因進行了克隆[9-10]。本試驗就高效產亞硝酸還原酶乳酸菌菌株的選育及特性進行探討，為深入研究生物酶法消除食品中亞硝酸鹽提供一定的基礎，也為實現發酵辣椒的純種發酵并使之標準化、規模化、安全化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌：從傳統發酵辣椒中利用MRS培養基篩選得到。

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 L；MRS瓊脂培養基：MRS液體培養基+瓊脂15.0 g；亞硝酸鈉鹽培養基：MRS液體培養基+亞硝酸鈉2g。

上述培養基均調節pH 6.2～6.4，121℃滅菌15 min。

pH 6.8磷酸鹽緩沖液亞硝酸鈉鹽培養基：亞硝酸鈉鹽培養基+磷酸鹽緩沖液，調節pH 6.8，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

DL-1 220V電爐：北京中興偉業儀器有限公司；BCD-318WSL冰箱：青島海爾股份有限公司；CP214電子天平：長沙鼎程科學儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州市漢達工業自動化有限公司；PX-25085-II恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；LMQ.J3870C立式滅菌鍋：山東新華醫療器械股份有限公司；pHS-3C型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；78-2磁力攪拌器：常州華普達教學儀器有限公司；CX21BIM-SET5奧林巴斯顯微鏡：上海豫光儀器有限公司；722分光光度計：上海宜友電子科技有限公司；JSM-6380LV掃描電鏡：日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌落與形態特征觀察

將實驗室保存的乳酸菌在MRS液體培養基中活化后，取種齡為24 h的菌種，劃線于MRS瓊脂平板，37℃恒溫培養24～48 h，記錄菌落特征，同時挑取單一菌落進行革蘭氏染色鏡檢和掃描電子顯微鏡觀察[11-12]，記錄形態特征。

1.3.2 優良降亞硝酸鹽短乳桿菌L5的初篩

將1.3.1鑒定的G+短乳桿菌菌株在MRS液體培養基中活化后，取種齡為24 h的菌種，按1 g/L接種量接種于亞硝酸鈉鹽培養基中，37℃恒溫培養，分別檢測第12 h和36h發酵液中NaNO2含量與pH值，同時做不接種對照試驗[13]。

1.3.3 產亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌L5的復篩

pH 6.8磷酸鹽緩沖液亞硝酸鈉鹽培養基篩選L5：將初篩得到的優良降亞硝酸鹽的短乳桿菌菌株在MRS液體培養基中活化，取種齡為24 h的菌種，按1 g/L接種量接種于pH 6.8磷酸鹽緩沖液亞硝酸鈉鹽培養基中，37℃恒溫培養，分別檢測12 h和36 h發酵液中NaNO2含量與pH值，同時做不接種對照試驗。

調節酸度篩選產亞硝酸鹽還原酶的L5：將初篩得到的優良降亞硝酸鹽的短乳桿菌菌株在MRS液體培養基中活化，取種齡為24 h的菌種，按1 g/L接種量接種于亞硝酸鈉鹽培養基中，于發酵罐中37℃恒溫培養，通過自動滴加NaOH維持pH值6.8，分別檢測12 h、24 h、36 h發酵液中NaNO2含量與pH值，同時做不接種對照試驗，不接種對照組滴加蒸餾水，保持接種組和對照組最終體積一致[14]。

1.3.4 L5降解亞硝酸鹽的最佳條件研究

L5降解亞硝酸鹽的最佳底物濃度研究：將在MRS液體培養基中培養24 h的L5菌液以1 mL的接種量分別接入100 mL含30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、150 mg/L亞硝酸鈉的MRS液體培養基中，37℃恒溫培養，分別檢測12 h、36 h發酵液中NaNO2含量，以相同條件下的空白培養基作對照。

L5降解亞硝酸鹽的最佳溫度研究：將在MRS液體培養基中培養24 h的L5菌液以1 mL的接種量接入100 mL含100 mg/L亞硝酸鈉的MRS液體培養基中，分別在25℃、30℃、34℃、37℃、42℃條件下培養，分別檢測12 h、36 h發酵液中NaNO2含量，以相同條件下的空白培養基作對照。

L5降解亞硝酸鹽的最佳氯化鈉含量研究：用氯化鈉將100 mL含100 mg/L亞硝酸鈉的MRS液體培養基調至0、4%、6%、8%、10%、12%的不同鹽含量梯度系列，將在MRS液體培養基中培養24 h的L5菌液以1 mL的接種量接入其中，37℃恒溫培養，分別檢測12h、36h發酵液中NaNO2含量，以相同條件下的空白培養基作對照。

L5降解亞硝酸鹽的最佳培養時間及降解速率研究：將在MRS液體培養基中培養24 h的L5菌液以1 mL的接種量接入100 mL不加食鹽或添加4%食鹽的含100 mg/L亞硝酸鈉的MRS液體培養基中，37℃恒溫培養，分別檢測12 h、24h、36h、48h、60h、72h發酵液中NaNO2含量，以相同條件下的空白培養基作對照。

L5降解亞硝酸鹽最佳條件的正交試驗設計：為確定L5降解亞硝酸鹽的最佳條件，設計以溫度、時間、底物濃度和食鹽濃度的4因素3水平L9（34）正交試驗。

1.3.5 亞硝酸鹽測定

亞硝酸鹽含量跟據GB/T 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定[15]。

2 結果與分析

2.1 L5的菌落與形態特征

2.1.1 L5的菌落特征

L5經48 h培養，平板表面長出大小幾乎一致，直徑約1 mm的圓形菌落，隨培養時間的延長而變大，菌落表面光滑、黏稠，呈灰白色、凸起[17]。

2.1.2 L5的形態特征

自然狀態下的乳酸菌大多數為桿菌，其中還有少量球菌，其寬0.35～0.50μm，長0.8～2.0μm，兩端平，無芽孢[18-19]。本試驗所選育出的L5菌株形態特征經革染鏡檢和掃描電鏡觀察如圖1、圖2所示，結果鑒定為G+短乳桿菌。

2.2 優良降亞硝酸鹽短乳桿菌L5的初篩結果分析

亞硝酸鈉鹽培養基中亞硝酸鹽降解率見表1。由表1可知，隨著發酵時間的延長，發酵液中亞硝酸鹽含量都有所降低，且在同一時間，短乳桿菌菌株不同，發酵液中亞硝酸鹽降解量也不同。另外由乳酸菌在代謝過程中不斷產生乳酸致發酵液中pH值不斷下降，可知，乳酸菌對亞硝酸鹽具有一定的降解作用。

圖2 L5菌株電鏡圖Fig.2 Electron microscopy figure of strain L5

表1 亞硝酸鈉鹽培養基中亞硝酸鹽降解率Table 1 Degradation rate of nitrite in sodium nitrite culture medium

2.3 產亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌L5的復篩

2.3.1 pH 6.8磷酸鹽緩沖液亞硝酸鈉鹽培養基篩選L5

pH 6.8磷酸鹽緩沖液篩選的結果見表2。由表2可知，發酵至12 h時，發酵液中pH值始終維持在＞6.00，而發酵液中亞硝酸鹽含量都有所降低，由此可初步推測亞硝酸鹽的降解與乳酸菌體內酶的作用也有關。當發酵至36 h時，培養基中的pH值都降至了5.00左右，因為乳酸的作用，尚不能確定哪株菌株產亞硝酸鹽還原酶能力強。因此，將這10株菌株在培養過程中不斷的調節酸度，以維持其pH值＞6.00。

表2 pH6.8磷酸鹽緩沖液亞硝酸鈉鹽培養基中亞硝酸鹽的降解率Table 2 Degradation rate of nitrite in phosphate buffer sodium nitrite culture medium(pH 6.8)

2.3.2 調節酸度篩選產亞硝酸鹽還原酶的L5

調節酸度篩選的結果見表3。由表3可知，通過控制發酵液中的pH值，使其始終維持在＞6.00，消除酸對亞硝酸鹽的降解作用后，上述乳酸菌仍具有較強的降解亞硝酸鹽作用。由此可推測上述乳酸菌對亞硝酸鹽的降解作用包括酸降解和酶降解，但不同菌株之間降解能力有所差異，其中5號菌株降解能力最強，其降解率為66.42%。

表3 控制發酵液的pH值的亞硝酸鹽的降解率Table 3 Degradation rate of nitrite in pH controlled medium

2.4 L5降解亞硝酸鹽的最佳條件研究結果分析

2.4.1 L5降解亞硝酸鹽的最佳底物濃度結果分析

由圖3可知，L5降解亞硝酸鹽的量在L5培養12 h之前是隨著亞硝酸鹽濃度的增加而增加的，但隨著時間的延長，培養至36 h、底物濃度為120 mg/L時亞硝酸鹽降解率出現了最大值，因此可以初步判斷其最適合的底物濃度為120 mg/L左右。

圖3 底物濃度對亞硝酸鹽降解量的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on nitrite degradation

2.4.2 L5降解亞硝酸鹽的最適溫度結果分析

圖4 溫度對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.4 Effect of temperature on nitrite degradation rate

由圖4可知，不同溫度條件下L5都有降解亞硝酸鹽的作用，隨著時間的延長，不同溫度對亞硝酸鹽的去除作用有很大的差異，溫度在34℃和37℃時，發酵液中亞硝酸鹽的降解率明顯高于25℃和30℃時亞硝酸鹽的降解率，由此可以找出其最佳降解亞硝酸鹽的溫度為34℃左右。

2.4.3 L5降解亞硝酸鹽的最佳食鹽濃度結果分析

圖5 食鹽濃度對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.5 Effect of salt concentration on nitrite degradation rate

由圖5可知，食鹽對L5降解亞硝酸鹽的影響是非常大的，L5發酵液在加2%或4%食鹽時亞硝酸鹽幾乎全部降解，但隨著食鹽濃度的增加，其降解率不斷減少，由此可以看出，食鹽對L5降解亞硝酸鹽有明顯的抑制作用，且乳酸菌降解亞硝酸鹽量與培養液中氯化鈉含量有極顯著的負相關。

2.4.4 L5降解亞硝酸鹽的最佳培養時間及降解速率結果分析

圖6 時間對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.6 Effect of time on nitrite degradation

由圖6可知，L5培養36 h之前發酵液中的亞硝酸鹽降解速率比較快，而在36 h之后降解速率比較慢，到最后幾乎不降解。同時其pH值變化和亞硝酸鹽降解量幾乎是同步的。因此在接種發酵時，應接種培養為36 h左右的乳酸菌。

2.4.5 L5降解亞硝酸鹽最佳條件研究正交試驗結果分析

根據單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗結果優化L5降解亞硝酸鹽的最佳條件。試驗設計及結果見表4，方差分析結果見表5。

表4 亞硝酸鹽降解條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test for nitrite degradation rate conditions optimization

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test results

根據表4極差值分析結果可以得出，各因素由主到次的順序對短乳桿菌L5降解亞硝酸鹽的影響是：底物濃度＞溫度、食鹽濃度＞培養時間。最優組合為A2B2C3D1，即溫度34℃，時間30 h，底物濃度120 mg/L，食鹽濃度6%，在最優水平條件下L5對亞硝酸鹽降解率為82.84%。

方差分析結果表明因素底物濃度對試驗結果的影響極顯著（P＜0.01），而因素溫度和食鹽濃度則達到了顯著的水平（P＜0.05）。

3 結論

從傳統發酵辣椒中分離出10株可降解亞硝酸鹽的乳酸菌，經過復篩得到一株產亞硝酸鹽還原酶能力最強的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）L5。

L5對亞硝酸鹽有明顯的降解作用，在正常培養條件下，發酵36 h，L5對亞硝酸鹽的降解率為56.25%；在維持pH 6.0以上，消除酸對亞硝酸鹽降解作用的條件下，發酵36 h，L5對亞硝酸鹽的降解率為66.42%，主要為產酶降解。

通過單因素試驗和正交試驗，得出L5降解亞硝酸鹽的最佳條件為溫度34℃，時間30 h，底物濃度120 mg/L，食鹽濃度6%。此條件下，L5對亞硝酸鹽的降解率可達82.84%。

[1]GANGOLLI S D,BRANDT P A,FERON V J,et al.Nitrates,nitritesandntitroso compounds[J].Environ Toxicol Pharm,1994,29(2):l-38.

[2]劉近周，彭恕生，林希蘊.大蒜阻斷亞硝胺的化學合成[J].營養學報，1986，8（1）：9-13.

[3]鐘艷清，夏延斌.自然發酵辣椒中一株乳酸菌的分離篩選及鑒定[J].農產品加工學刊，2011（11）：52-54.

[4]唐發書，賈仁勇，彭順清，等.葡萄糖和維生素C（VitC）對香腸中亞硝酸鹽殘留量的影響[J].四川畜牧獸醫學院學報，2000，14（3）：36-38.

[5]YOON J H,KANG S S,MHEEN T I,et al.Lactobacillus kimchiisp. nov,a new species from kimchi[J].Int J Syst Evol Micr,2000,50(5): 1789-1795.

[6]唐愛明.乳酸菌降解肉制品中亞硝酸鹽機理及菌株篩選研究[D].長沙：湖南農業大學碩士論文，2004：59-62.

[7]閆金星，許潤博，陳萍，等.產亞硝酸鹽還原酶的乳酸菌的篩選及誘變[J].吉林農業大學學報，2013，35（1）：94-97.

[8]張慶芳，遲乃玉，鄭燕，等.乳酸菌降解亞硝酸鹽機理的研究[J].食品與發酵工業，2002，28（8）：27-31.

[9]何婷婷.植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶編碼基因的研究[D].上海：上海師范大學碩士論文，2012.

[10]呂玉濤.產亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌發酵條件優化及酶的分離純化研究[D].上海：上海師范大學碩士論文，2010.

[11]蘇世彥.食品微生物檢驗手冊[M].北京：中國輕工業出版社，1998.

[12]馬蓓，劉偉，謝蓉蓉，等.乳酸菌掃描電鏡制樣方法及觀察條件探究[J].內蒙古科技與經濟，2012（2）：116-119.

[13]馬延巖.泡菜發酵過程中亞硝酸鹽生成及降解機理研究[J].食品科技，2013，38（10）：277-280.

[14]黃麗慧，張雁，陳于隴，等.發酵蔬菜中亞硝酸鹽消長規律及調控技術的研究進展[J].食品科學，2013，34（5）：303-307.

[15]中華人民共和國衛生部.GB/T 5009.33—2010食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[16]劉紹.食品分析與檢測[M].武漢：華中科技大學出版社，2011：127.

[17]趙國屏.生物信息學[M].北京：科學出版社，2003：101-111.

[18]王昌祿，隋志文，武晉海，等.亞硝酸鹽降解菌的分離及其特性研究[J].中國釀造，2008，27（9）：33-36.

[19]李春，韓建春，鄭凱.乳酸菌混合生長降解亞硝酸鹽能力的研究[J].工業微生物，2008，38（6）：23-26.

Screening of nitrite reductase producingLactobacillus brevisL5 from fermented chili and its characteristic study

WANG Lan1,ZHAO Lingyan1,CHEN Sisi1,WANG Xueyan1,YOU Jing2,DENG Fangming1*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Dingcheng District Bureau of Quality and Technical Supervision,Changde 415100,China)

Ten lactic acid bacteria strains that can degrade nitrite were isolated from traditional fermented chili.One strain which had better ability of producing nitrite reductase were rescreened,namelyLactobacillus brevisL5,then single factor and orthogonal tests were adopted to study on its degradation characteristics.Results showed that the L5 had significant ability for degrading nitrite,and under normal culture condition,the nitrite degradation rate was 56.25%after 36 h fermentation.In controlling pH above 6.0,eliminating the acid degradation,the nitrite degradation rate was 66.42%,mainly as enzymatic degradation.The optimum conditions for nitrite degradation of the L5 was temperature 34℃,time 30 h,substrate concentration 120 mg/L and salt concentration 6%.In this condition,the nitrite degradation rate of the L5 was 82.84%.

fermented chili;nitrite;nitrite reductase;Lactobacillus brevisL5;characteristics

TS201.3

A

0254-5071（2014）11-0025-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.006

2014-09-04

國家自然科學基金（31401675）；教育部基金（SCX1211，14C0571）

王蘭（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

*通訊作者：鄧放明（1962-），男，教授，博士，研究方向為食品加工技術。