絲狀真菌發酵木糖產乙醇的研究

石琢，李清明，，熊興耀，溫潛，胡秋龍，蘇小軍，*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南長沙410128；3.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京100081）

絲狀真菌發酵木糖產乙醇的研究

石琢1，李清明1，2，熊興耀2，3，溫潛1，胡秋龍2，蘇小軍1，2*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南長沙410128；3.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京100081）

以木質纖維素為原料生產燃料乙醇是目前的一個研究重點，其中利用木糖產乙醇微生物的研究尤為重要。本文簡要概述了自然界中能利用木糖產乙醇的幾種主要絲狀真菌及基因工程技術在之研究中的應用，并展望了今后的研究方向。

絲狀真菌；發酵；木糖；乙醇

伴隨著經濟的快速增長，石油、煤等不可再生能源遭到了過度的開發利用，這些化石能源正一步步走向枯竭，為此開發新的可再生能源迫在眉睫。生物質燃料乙醇是一種可再生的清潔能源，它不僅可以代替對水資源有污染的汽油增氧劑甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE），還能使燃燒更加充分并能使顆粒物、揮發性有機化合物、CO等大氣污染物的排放量平均降低1/3以上[1-2]。木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，分別約占35%～50%、20%～35%和10%～15%[3]。纖維素的降解產物以六碳糖為主，而半纖維素的降解產物則以五碳糖為主[4]。木糖是木質纖維素水解后的主要五碳糖，占總糖含量的10%～40%[3-4]。自然界中許多微生物能利用木糖產乙醇，如樹干畢赤酵母、管囊酵母等，但普遍存在乙醇轉化效率不高的問題[5]。因此，對于能利用木糖產乙醇的微生物的研究就顯得十分重要。絲狀真菌具有豐富的木質纖維素酶酶系，已被廣泛應用于木質纖維素的酶解和纖維素酶的生產當中，是工業用纖維素酶的主要生產菌種之一[6]。目前關于絲狀真菌在纖維乙醇上的應用研究主要集中在產酶和酶解機制等方面，而對于利用絲狀真菌轉化乙醇的研究較少[7-8]。一些絲狀真菌如粗糙脈孢菌、尖孢鐮刀菌等，不僅可以快速降解木質纖維素，而且還具備利用木糖、纖維二糖、寡糖等轉化為乙醇的能力[8-9]。如何開發利用這些具備木糖乙醇轉化能力的菌株，為木糖乙醇發酵提供新的菌種資源是目前纖維乙醇領域的一個重要方向。本文簡要綜述了幾種主要絲狀真菌利用木糖產乙醇的研究進展，并對以后的研究方向進行了展望。

1 絲狀真菌

絲狀真菌俗稱霉菌，意指“會引起物品霉變真菌”，通常指那些菌絲體較發達又不產大型肉質子實體結構的真菌。絲狀真菌形態較大，質地疏松，外觀干燥，不透明；菌落與培養基緊密相連，不易挑取；菌落顏色有紫色、白色和奶黃色等。絲狀真菌營養體的基本單位是菌絲，根據菌絲是否有隔膜分為無隔菌絲和有隔菌絲兩類。絲狀真菌的繁殖能力很強，主要通過產生大量的無性孢子或有性孢子完成；在通氣攪拌或振蕩的霉菌液體培養基中，通常會產生菌絲球[10]。

2 絲狀真菌在利用木糖產乙醇微生物中的地位

目前已經發現的能利用木糖的微生物超過100種，包括細菌、真菌和酵母菌[11]。絲狀真菌在木糖發酵微生物的研究中占主要地位，是一類具有很大開發應用前景的微生物。從表1可以看出，與其他微生物相比，絲狀真菌不僅能代謝葡萄糖、甘露糖和半乳糖等六碳糖，還能有效地利用木糖和阿拉伯糖等五碳糖，且在發酵過程中所形成的產物主要為乙醇，并對乙醇和酸都有很好的耐受能力，可在無氧的條件下發酵[12]。

表1 多種天然微生物生產乙醇的利弊比較Table 1 Pros and cons of various natural microorganisms for ethanol production

3 絲狀真菌利用木糖的代謝途徑

目前許多研究認為，絲狀真菌按圖1的代謝路徑利用木糖生產乙醇[13-15]。絲狀真菌首先在木糖還原酶（xylose reductase，XR）的作用下將木糖還原成木糖醇，然后在木糖醇脫氫酶（xylitol dehydrogenase，XDH）的作用下轉化為木酮糖，且這兩個環節均需要還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）作為輔酶。木酮糖激酶（xylulokinase，XK）將木酮糖磷酸化生成5-磷酸木酮糖，經過磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）后生成的6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油醛進入糖酵解途徑，生成糖代謝的中心產物丙酮酸，在缺氧條件下丙酮酸被丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶脫羧還原成乙醇。

圖1 絲狀真菌木糖代謝途徑Fig.1 Xylose metabolic pathway of filamentous fungi

4 自然界中能發酵木糖產乙醇的絲狀真菌

自然界中能發酵木糖產乙醇的絲狀真菌種類較多，但相關研究較少，研究較多的有腐生真菌、木霉、粗糙脈孢菌和尖孢鐮刀菌等[16-22]。

4.1 腐生真菌

腐生真菌是一類從已死動植物或其他有機質中吸取營養以維持自身正常生活的微生物，它們能有效地降解木質纖維素，是纖維素乙醇研究中的熱門菌種。金花等[23]研究表明，腐生真菌（Mucor indicus）在以木糖、葡萄糖為共同碳源的發酵體系中乙醇轉化率可達0.46 g/g（乙醇產量/耗糖量），不同碳源條件下乙醇轉化率高低順序為（木糖+葡萄糖）＞葡萄糖＞木糖。在濕氧化預處理的小麥秸稈水解液培養基中，腐生真菌（Mucor indicus）乙醇轉化率最高為0.37g/g。Mucor indicus能較好地代謝混合糖（木糖+葡萄糖），且乙醇轉化率接近理論值0.51 g/g。但Mucor indicus在以木糖為唯一碳源時，乙醇轉化率不高，只有理論值的35%。

褐色腐生真菌（Neolentinus lepideus）不僅能利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、纖維二糖、麥芽糖和乳糖生產乙醇，而且還具有完整的木質纖維素降解酶系，能直接發酵麥麩等生物質原料。褐色腐生真菌（N.lepideus）在好氧、半好氧及缺氧條件下均能代謝木糖，在5%的木糖發酵培養基中，乙醇產量分別為0.30 g/g、0.33 g/g、0.34 g/g，且分別在發酵96 h、96 h、192 h將木糖消耗完畢[24]。

4.2 粗糙脈孢菌

粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）屬于脈孢菌屬，具有完整的木質纖維素降解酶系，能有效地利用木糖和葡萄糖發酵生產乙醇[8]。在小麥秸稈和麥麩的固體培養基中，粗糙脈孢菌能分泌內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶及β-木糖苷酶，產量分別可達492.8 U/g、1.08 U/g、26.7 U/g、297.8 U/g和0.132 U/g，高效分泌的木聚糖酶能將木聚糖降解為木糖和低聚木糖，能有效提高纖維乙醇產量[25]。張瀟等[9]研究了通氧量、培養基初始pH值、初始木糖濃度等因素對粗糙脈孢菌發酵木糖的影響，得出了粗糙脈孢菌適合在半好氧條件下產乙醇的結論，乙醇轉化率達到63.2%。ZHANG Z H等[20]的研究了傳氧速率對粗糙脈孢菌AS3.1602木糖發酵、細胞內新陳代謝以及關鍵酶的影響，在傳氧速率為8.4 mmol/（L·h）時，乙醇產量最高，為0.34 g/g。并認為在缺氧條件下粗糙脈孢菌幾乎不代謝木糖。LI J G等[26]對粗糙脈孢菌木糖代謝途徑的轉錄組進行研究，并運用分層聚類分析等方法將葡萄糖、阿拉伯糖代謝途徑的轉錄組進行比對。研究表明，同為戊糖的阿拉伯糖的基因表達圖譜與木糖的完全不同，并發現XAT-1（NCU01132）、XYT-1（NCU05627）基因與木糖和阿拉伯糖的代謝有關。

4.3 尖孢鐮刀菌

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）能有效利用葡萄糖和木糖，且能同時糖化和發酵木質纖維素[21]。范金霞等[27]的研究表明，尖孢鐮刀菌以純葡萄糖為發酵底物的乙醇產量為8.50 g/L，高于以純木糖為發酵底物的5.77 g/L，而在以葡萄糖/木糖為碳源的混合糖發酵中，葡萄糖和木糖比值為3∶1時乙醇產量最大，為7.53 g/L。已報道的產乙醇含量較高的尖孢鐮刀菌是VTT-D-80134，在適當條件下乙醇產量可達0.5 g/g[28]。尖孢鐮刀菌對發酵液中的抑制物有較好的耐受性，且對單一抑制物的耐受性強于混合抑制物。尖孢鐮刀菌發酵產乙醇時對抑制物的耐受性為甲酸＜乙酸＜香草醛＜鄰苯二酚＜糠醛[29]。范金霞等[30]還首次報道了尖孢鐮刀菌的乙醛脫氫酶基因DNA序列，挖掘出了23條假定乙醛脫氫酶基因，并獲得了aldn-19的核苷酸序列。

5 基因工程技術在絲狀真菌研究中的應用

絲狀真菌雖然能利用木糖產生乙醇，但轉化效率并不理想，因此選育發酵性能優良的菌株就顯得尤為重要，而基因工程技術的應用為獲得高產菌株提供了可能。利用基因工程技術獲得高效代謝木糖產乙醇菌株的研究思路主要有兩條：一是向能高效利用六碳糖產乙醇的菌種中引入五碳糖代謝途徑；二是向能利用混合糖但乙醇產量低的菌種中引入高效產乙醇的基因[31]。因酵母菌、大腸桿菌能高效利用葡萄糖，因此目前對酵母菌、大腸桿菌等菌種進行基因重組的研究較多，研究工作主要集中在引入五碳糖途徑[32-33]。相比之下，對絲狀真菌進行基因改良的研究不多，主要為從絲狀真菌中挖掘五碳糖代謝關鍵基因，將其重組到能高效代謝葡萄糖的菌株中。

SALOHEIMO A[34]等成功地將絲狀真菌里氏木霉（Trichderma reesei）的hxt1、hxt2、hxt4、hxt7和trxlt1五碳糖轉運因子基因重組到酵母中，有效提高了木糖利用率。向尖孢鐮刀菌中載入endo-β-1,4-xylanase 2基因，有效提高了細胞外液木聚糖酶的活躍度，得到的轉化株發酵玉米芯產乙醇含量比野生菌株高出約60%，尖孢鐮刀菌木聚糖酶同源超表達能增強尖孢鐮刀菌在聯合生物發酵（consolidated bioprocessing，CBP）模式下的發酵性能[35]。

6 展望

在纖維乙醇研究中，木糖的高效轉化是重要內容之一。絲狀真菌能廣泛地利用包括木糖在內的多種糖類，具有很好的研究和開發前景。但野生絲狀真菌還存在利用木糖速率較慢，產乙醇能力不強、產副產物較多等問題。因此，需要對現有菌株進行改良。采用比較基因組學的方法研究絲狀真菌利用木糖產乙醇的代謝途徑，明確關鍵基因，進而利用基因工程技術培育新的菌株，是新的研究領域。此外，進一步挖掘新的菌株資源也仍然是一項十分重要的工作。

[1]黃進，夏清，鄭化.生物質化工與生物質材料[M].北京：化學工業出版社，2009.

[2]張繼泉，王瑞明，孫玉英.利用木質纖維素生產燃料酒精的研究進展[J].釀酒科技，2003（1）：39-42.

[3]李學鳳，田沈，潘亞平，等.發酵五碳糖和六碳糖產乙醇的細菌研究進展[J].微生物學報，2003，30（6）：101-105.

[4]余紫蘋，彭紅，林妲，等.植物半纖維素結構研究進展[J].高分子通報，2011，1（6）：48-54.

[5]胡海軍，葛向陽，梁運祥.一株中型假絲酵母發酵木糖產乙醇的特性研究[J].微生物學通報，2008，35（10）：1511-1515.

[6]鄒根，劉睿，魏勇軍，等.木質纖維素酶基因資源挖掘及真菌酶系改造[J].生物加工過程，2014（1）：63-71.

[7]鐘耀華，錢遠超，任美斌，等.絲狀真菌降解轉化纖維素的機制與遺傳改良前景[J].生物加工過程，2014（1）：46-54.

[8]林良才，李金根，王邦，等.粗糙脈孢菌木質纖維素降解利用研究進展[J].生物加工過程，2014，12（1）：28-36.

[9]張瀟，朱冬青，王丹，等.粗糙脈孢菌木糖發酵的研究[J].微生物學報，2003，43（4）：466-472.

[10]周德慶.微生物學教程[M].第二版.北京：高等教育出版社，2002.

[11]張穎，馬瑞強，洪浩舟，等.微生物木糖發酵產乙醇的代謝工程[J].生物工程學報，2010，26（10）：1436-1443.

[12]HAHN-H?GERDAL B,KARHUMAA K,FONSECA C,et al.Towards industrial pentose-fermenting yeast strains[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,74(5):937-953.

[13]賀應龍，熊興耀，蘇小軍.五碳糖發酵生產乙醇的菌種研究[J].中國釀造，2010，29（4）：8-11.

[14]ZALDIVAR J,NIELSEN J,OLSSON L.Fuel ethanol production from lignocellulose:a challenge for metabolic engineering and process integration[J].Appl Microbiol Biotechnol,2001,56(1-2):17-34.

[15]GìRIO F M,FONSECA C,CARVALHEIRO F,et al.Hemicelluloses for fuel ethanol:A review[J].Bioresource Technol,2010,101(13): 4775-4800.

[16]LIANG X H,HUA D L,WANG Z X,et al.Production of bioethanol using lignocellulosic hydrolysate by the white rot fungusHohenbuehelia sp.ZW-16[J].Ann Microbiol,2013,63(2):719-723.

[17]黃艷，覃擁靈，凌敏，等.不同碳源誘導康氏木霉產纖維素酶的研究[J].中國釀造，2008，27（15）：41-43.

[18]SUN Y,CHENG J Y.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanolproduction:a review[J].Bioresource Technol,2002,83(1):1-11.

[19]HASPER A A,VISSER J,DE GRAAFF L H.TheAspergillus niger transcriptional activator XlnR,which is involved in the degradation of the polysaccharides xylan and cellulose,also regulates D-xylose reductase gene expression[J].Mol Microbiol,2002,36(1):193-200.

[20]ZHANG Z H,QU Y B,ZHANG X,et al.Effects of oxygen limitation on xylose fermentation,intracellular metabolites,and key enzymes of Neurospora crassaAS3.1602[J].Appl Biochem Biotechnol,2008,145 (1-3):39-51.

[21]黃茜，黃鳳洪，江木蘭，等.木質素降解菌的篩選及混合菌發酵降解秸稈的研究[J].中國生物工程雜志，2008，28（2）：66-70.

[22]RUIZ E,ROMERO I,MOYA M,et al.Sugar fermentation byFusarium oxysporumtoproduceethanol[J].World J Microbiol Biotechnol,2007, 23(2):259-267.

[23]金花，陸軍，李濤，等.麥稈水解液發酵生產燃料乙醇的研究[J].釀酒科技，2007（12）：25-27.

[24]OKAMOTO K,KANAWAKU R,MASUMOTO M,et al.Efficient xylose fermentation by the brown rot fungusNeolentinus lepideus[J].Enzyme Microb Tech,2012,50(2):96-100.

[25]DOGARIS I,VAKONTIOS G,KALOGERIS E,et al.Induction of cellulases and hemicellulases fromNeurospora crassaunder solid-state cultivation forbioconversion ofsorghum bagasse into ethanol[J].Ind Crop Prod,2009,29(2-3):404-411.

[26]LI J G,LIN L C,LI H Y,et al.Transcriptional comparison of the filamentous fungusNeurospora crassagrowing on three major monosaccharides D-glucose,D-xylose and L-arabinose[J].Biotechnol Biofuels, 2014,31(7):1-15.

[27]范金霞，楊謙，陳忠祥，等.尖孢鐮刀菌發酵混合糖產乙醇[J].東北林業大學學報，2010，38（9）：113-115.

[28]范金霞，楊謙.木糖發酵產乙醇微生物研究進展[J].西南林學院學報，2009，29（5）：90-93.

[29]范金霞，李文哲，鄭國香，等.稀酸水解抑制物對尖孢鐮刀菌生長與乙醇發酵的影響[J].農業機械學報，2014，45（5）：155-159.

[30]范金霞，黃曉梅，張炳秀.尖孢鐮刀菌乙醛脫氫酶基因的特征分析[J].基因組學與應用生物學，2014，33（2）：260-265.

[31]洪解放，張敏華，劉成，等.代謝木糖生產乙醇的基因工程菌研究進展[J].食品與發酵工業，2005，31（1）：114-118.

[32]ZHA J,SHEN M H,HU M L,et al.Enhanced expression of genes involved in initial xylose metabolism and the oxidative pentose phosphate pathway in the improved xylose-utilizingSaccharomyces cerevisiae throughevolutionaryengineering[J].J Ind Microbial Biotechnol,2014, 41(1):27-39.

[33]李偉麗，李海燕，李良，等.熱休克蛋白增加大腸桿菌抗逆性和乙醇產量的研究[J].生物技術，2008，18（5）：54-58.

[34]SALOHEIMO A,RAUTA J,STASYK O V,et al.Xylose transport studies with xylose-utilizingSaccharomyces cerevisiaestrains expressing heterologous and homologous permeases[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,74(5):1041-1052.

[35]ANASONTZISA G E,ZERVA A,STATHOPOULOU P M,et al.Homologous overexpression of xylanase inFusarium oxysporumincreases ethanol productivity during consolidated bioprocessing(CBP)of lignocellulosics[J].J Biotechnol,2011,152(1-2):16-23.

Ethanol production with xylose fermentation by filamentous fungi

SHI Zhuo1,LI Qingming1,2,XIONG Xingyao3,WEN Qian1,HU Qiulong2,SU Xiaojun1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization,Changsha 410128,China; 3.The Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Beijing 100081,China)

Fermentation of lignocelluloses for ethanol production has become a research focus,with special emphasis on the study of microorganism for fermenting xylose to ethanol.Several filamentous fungi which can use xylose for ethanol production and the application of genetic engineering technology in the study were introduced in this paper.In addition,the research prospect was discussed.

filamentous fungi;fermentation;xylose;ethanol

TQ223.122

A

0254-5071（2014）11-0047-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.010

2014-09-19

國家重點基礎研究發展計劃‘973計劃’（2012CB723004）

石琢（1991-），女，碩士研究生，研究方向為生物質能源。

*通訊作者：蘇小軍（1975-），男，副研究員，博士，研究方向為生物質能源。