篩網對木葡糖醋桿菌變異的控制

王志國，李從發，鐘春燕，向東，王錫彬

（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.海南椰國食品有限公司，海南海口570311）

篩網對木葡糖醋桿菌變異的控制

王志國1，李從發1，鐘春燕1，向東1，王錫彬1

（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.海南椰國食品有限公司，海南海口570311）

以1 000 mL燒杯為容器，木葡糖醋桿菌在靜置培養時，培養液體積為100 mL時，沒有變異；增至300 mL時，發生變異，纖維素產量下降38.8%，培養液體積增至700 mL時，變異菌數量高達1.3×106CFU/mL，纖維素產量下降76.3%；120 r/min振蕩培養更易發生變異，兩種方式培養下的變異現象通過篩網使用而得到控制，從而提高了纖維素產量。

木葡糖醋桿菌；變異；篩網

木葡萄醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）產生的纖維素稱為細菌纖維素（bacterial cellulose，BC），因其純度、結晶度、持水力、楊氏模量高及生物相容性好等獨特性能，被廣泛應用于食品、醫藥、造紙、音響等領域[1-3]。

利用木葡萄醋桿菌（Ga.xylinus）生產BC的方式主要有靜置培養和攪拌培養2種。攪拌培養法容易在工業發酵罐中進行，而且克服了靜置培養中的諸如勞動強度大，占空間，生產效率低下等缺點，因此得以廣泛研究[4-6]。但攪拌培養法往往不能獲得如靜置培養中的膜狀BC，而呈現球狀、星狀、絮狀，而且攪拌培養中因為剪切力的存在，往往產生負變異菌株，導致BC產量降低，但剪切力如何使其變異的機制尚不清楚[7-8]。

目前國內外控制變異菌的主要方法是篩選適合攪拌培養的菌株，比如Ga.xylinusBPR2001在攪拌培養中很穩定。在研究Ga.xylinus靜置[9]及攪拌培養中的變異問題時發現，2種培養方式條件下的變異現象，可以通過安裝篩網得以控制，在靜置培養中篩網的作用類似于淺層培養，因為Ga.xylinus在淺層培養中很穩定，在攪拌培養中，篩網起到了黏附纖維素的作用，從而減弱了剪切力對菌體的破壞，從而提高了BC產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木葡萄醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）：海南大學食品學院分離保存。

液體培養基：葡萄糖2.0 g、蛋白胨0.5 g、酵母膏0.5 g、檸檬酸0.115 g、磷酸氫二鈉0.27 g，加入100 mL水中，pH 5.0，121℃滅菌20 min。

固體培養基：上述液體培養基中加入2.0 g瓊脂。

葡萄糖、檸檬酸、磷酸氫二鈉均為分析純：天津大茂化學試劑廠；蛋白胨、酵母膏、瓊脂：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫療器械有限公司；SHP-1500生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州市華普達教學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液制備及培養

種子液制備：固體培養基上在30℃條件下培養10 d，挑取10個菌落接入100 mL液體培養基中，30℃條件下，靜置培養4 d。

培養方法：種子液按體積分數5%接入液體培養基中，30℃條件下靜置培養或120 r/min搖床振蕩培養4 d。

1.3.2 篩網的制作

靜置培養用篩網的制作：用孔徑為1 mm的不銹鋼篩網作材料，中間打1小孔，使其易插入玻璃棒，玻璃棒下端插入至膠塞中，使篩網便于放置在1 000 mL燒杯中（見圖1A），篩網離液面的高度視培養液體積而定，當培養液為300 mL時，則使篩網處于200 mL處，以此類推，調節篩網的高度，使其適合于500 mL及700 mL培養液的使用。

振蕩培養用篩網的制作：選取同靜置培養一樣的材料，根據燒杯的大小裁成長方形，其在燒杯中的高度約高于培養液的液面1 mm（見圖1B）。

圖1 靜置(A)及振蕩(B)培養篩網Fig.1 Beakers with stainless steel mesh filter used forGa.xylinus under stationary cultivation(A)and shake cultivation(B)

1.3.3 分析方法

變異菌的計數：培養液經梯度稀釋后，涂布于瓊脂平板上，根據變異菌落的形態特征計數。

細菌纖維素（BC）的產量測定：收集纖維素，置于80℃、0.1 mol/L NaOH溶液中，維持2 h，冷卻后用0.1 mol/L HCl中和，自來水充分洗滌，在80℃條件下干燥至質量恒定[10]，稱細菌纖維素質量。

2 結果與分析

2.1 變異菌與正常菌的差異

培養液經過合適稀釋，取0.1mL涂布于固體培養基上，30℃條件下培養7 d，結果見圖2。

由圖2可知，變異菌與正常菌的菌落外觀差異顯著，正常菌的菌落小而凸起，表面干燥，變異菌的菌落扁平而大，表面濕潤。

2.2 培養液體積對Ga.xylnius靜置培養中的變異及其BC

產量的影響

以1000mL燒杯為容器，木葡萄醋桿菌在靜置培養時，培養液體積分別為100 mL、300 mL及700 mL，在30℃條件下靜置培養4 d，對Ga.xylinus靜置培養中的變異菌數及其細菌纖維素產量的影響結果見圖3。

圖2 正常(A)及變異(B)Ga.xylinus菌落的形態Fig.2 Colonial morphology of normal strain(A)and abnormal strain(B)ofGa.xylinus

圖3 培養液體積對Ga.xylinus靜置培養中變異菌數量及BC產量的影響Fig.3 Effects of media volumes on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylniusunder stationary cultivation

由圖3可知，靜置培養過程中，變異菌數量與培養液體積負相關。培養液體積為100 mL時，Ga.xylinus未發生變異，培養液體積為300mL時，變異菌數量達到6×105CFU/mL，培養液體積為700 mL時，變異菌數量達到1.3×106CFU/mL，這與先前的實驗結論一致[9]。靜置培養中，細菌纖維素BC產量與培養液體積負相關。BC產量的差異達到極顯著（P＜0.01）。培養液體積為700mL時，BC產量僅為0.19 g/L，其大小只有培養液體積為100 mL時（0.80 g/L）的1/5。

研究表明，Ga.xylinus靜置培養時，BC產量與氣/液界面的面積正相關，與培養液體積無關，因為在氣/液界面有充足的氧氣，Ga.xylinus能很好地生長繁殖及產生BC[11-12]。但SURMA-LUSARSKAB等[13]發現培養液體積在50～200mL之間變化時，BC產量與培養液體積負相關。出現這些不一致的結論的可能原因就在于所用的菌株是否在靜置培養條件下發生了變異。

不發生變異時，決定BC產量的關鍵因子為氣/液界面面積，而如果有變異菌株，BC產量則隨培養液體積增加而減小。本實驗中，培養液體積越多，BC產量越少，其原因是因為變異菌數越多。

2.3篩網對Ga.xylnius靜置培養中變異現象的抑制

當在靜置培養液（300 mL、500 mL、700 mL）中安裝篩網后，變異現象消失，且BC產量相差不大，結果見表1。

表1 篩網對Ga.xylinus靜置培養的變異菌數及BC產量的影響Table 1 Effects of mesh filter on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylinusunder stationary cultivation

由表1可知，BC產量相差不大的原因在于不同體積的培養液中，氣/液界面面積皆為78.5 cm2，而氣/液界面為細胞生長繁殖及產BC的最活躍層[14]，因此產量相當。而沒有安裝篩網，不同體積的培養液中盡管表面積一樣，但由于變異菌的出現，變異菌在表面占有生長優勢，導致BC產量下降，培養液體積越大，變異菌數量越多，因此BC產量更低。

2.4 篩網對Ga.xylnius振蕩培養中變異現象的抑制

表2 篩網對Ga.xylinus靜置及振蕩培養中變異菌數及BC產量的影響Table 2 Effects of mesh filter on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylinusunder stationary cultivation and shake cultivation

由表2可知，在1 000 mL燒杯中培養液體積500 mL時，在30℃條件下靜置及120 r/min振蕩培養4 d，Ga.xylnius衰退菌數量分別為1.2×106CFU/mL，3.5×106CFU/mL，二者差異極顯著（P＜0.01），說明振蕩培養更易使Ga.xylinus變異，這與前人的結論相符[15]；靜置培養中BC產量（0.28 g/L）約是振蕩培養中（0.03 g/L）的9倍，說明靜置培養中BC量比振蕩培養中高。

使用篩網后，2種培養方式中的變異都得到了控制（見表2），但BC產量差異仍極顯著（P＜0.01）。通常認為振蕩培養產BC效率低的原因是變異菌株的出現[7-8]，但從本實驗結果看，即使沒有變異現象，振蕩培養產BC效率仍較低（0.20 g/L），似乎振蕩培養BC產量低應有另外的原因。

振蕩培養中的剪切力作用，使Ga.xylnius易變異[7-8]，而篩網可以截留攜帶BC的細胞，使其定居下來，順利地在篩網上成膜，培養液體積為500 mL振蕩培養中，在篩網上產生的膜狀BC，消除或者抑制了剪切力對菌株的不良影響，從而抑制變異產生。

3 結論

Ga.xylinus在靜置培養時，培養液體積越大，變異越容易發生，從而導致BC產量降低，篩網的安裝，可以消除變異現象，此時培養液體積300～700 mL皆可，但所獲得的BC量差異不大；振蕩培養比靜置培養更容易發生變異，篩網安裝能消除變異現象，從而提高BC的產量。靜置培養中篩網的作用類似于淺層培養，因為Ga.xylinus在淺層培養中很穩定，在攪拌培養中，篩網起到了黏附纖維素的作用，從而減弱了剪切力對菌體的破壞，從而提高了BC產量。

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Inhibition of mesh filter on mutation ofGluconacetobacter xylinus

WANG Zhiguo1,LI Congfa1,ZHONG Chunyan2,XIANG Dong1,WANG Xibin1
(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China; 2.Hainan Yeguo Foods Co.,Ltd.,Haikou 570311,China)

Using 1 000 ml beaker as container,under stationary cultivation ofGluconacetobacter xylinus,mutation didn’t occur when the loading volume was 100 ml.However,mutation ofGa.xylinusoccurred under stationary cultivation in 300 ml medium,which led to decrease of bacterial cellulose(BC)yield by 38.8%.When the medium volume increased to 700 ml,BC yield decreased 76.3%,and the mutant bacterial number was 1.3×106CFU/ml.Compared with static cultivation,mutation rates ofGa.xylinuswere higher,when shaking at 120 r/min.Mutation was inhibited by mesh filter no matter which cultivation method was used.Thereby the cellulose production was increased.

Gluconacetobacter xylinus;mutation;mesh filter

Q939

A

0254-5071（2014）11-0067-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.015

2012-09-18

海南省重大科技項目（ZDZX2013011）

王志國（1974-），男，副教授，碩士，研究方向為食品微生物。