利用雅致放射毛霉制備水牛乳豆乳混合干酪工藝參數的優化

謝芳，曾慶坤，李玲，林波，唐艷，農皓如

（中國農業科學院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

利用雅致放射毛霉制備水牛乳豆乳混合干酪工藝參數的優化

謝芳，曾慶坤*，李玲，林波，唐艷，農皓如

（中國農業科學院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

為提高水牛乳豆乳混合干酪品質，分別利用單因素試驗及正交試驗對以雅致放射毛霉為表面發酵劑制備水牛乳豆乳混合發酵干酪的工藝進行了優化。通過優化確定了水牛乳豆乳混合干酪的最佳發酵條件為豆乳添加量15%，程序升溫至41℃，霉菌孢子噴霧濃度1×106CFU/mL，成熟時間為30 d。在此優化的工藝條件下，能得到較好品質的霉菌干酪產品。

雅致放射毛霉；水牛乳；豆乳；干酪

干酪（cheese）又稱奶酪，聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization，FAO）和世界衛生組織（World Health Organization，WHO）制定了國際上通用的干酪定義：干酪是以牛奶、稀奶油、部分脫脂奶、酪乳或這些產品的混合物為原料，經凝乳并分離出乳清而制得的新鮮或成熟的制品[1]。干酪以其水分含量為標準分為硬質、半硬質、軟質和再制干酪4種。在軟質干酪中，表面霉菌成熟干酪（surfacemould-ripened cheese）具有重要的地位[2]。

雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）是我國傳統腐乳釀造中常用的優良菌種之一，該霉菌可分泌多種酶系，對腐乳后期發酵過程中風味物質的形成起重要作用[3]。目前利用雅致放射毛霉發酵水牛乳制備干酪的研究仍十分薄弱，因此本研究將雅致放射毛霉菌應用到水牛乳、豆乳混合干酪的生產中，并對該混合干酪的關鍵工藝進行研究，以確定其最佳工藝參數，為后續此類干酪的研究和生產提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮無抗水牛乳（蛋白質4.33%，脂肪7.49%，pH6.3）：廣西壯族自治區水牛研究所種水牛場；黃豆：南寧市場。制作干酪前，將黃豆放在100℃的烘箱中加熱，加0.15% NaHCO3[4]，用兩倍冷水浸泡除去豆腥味，黃豆與水比例1∶8（g∶mL），經磨漿、過濾、煮沸后備用；R-704乳酸菌發酵劑：科漢森（中國）有限公司生產；雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）：中國科學院微生物研究所。

三氯乙酸、乙醚、冰乙酸：成都市科龍化工試劑廠；碳酸氫鈉：海聯鹽鹵化工有限公司；氫氧化鈉：天津博迪化工股份有限公司；乙醇、石油醚：天津市富宇精細化工有限公司；醋酸鈉、鹽酸、硫酸：廉江市愛廉化試劑有限公司；硫酸鉀、硫酸銅：菏澤大通化工有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MJX-250智能霉菌培養箱：上海百典儀器設備有限公司；BCD-208GSSMY美的冰箱：美的集團股份有限公司；干酪槽，干酪切割刀、模具：實驗室自制；FDM-2漿渣自分離磨漿機：北京集京昊晟食品機械有限公司；N100B牛奶分離機：漢謨機械（上海）有限公司；XS105DU電子天平：METTLERTOLEDO梅特勒-托利多公司；8400全自動定氮儀及消化爐：丹麥FOSS公司；PHS-3C數顯pH計：上海越磁電子科技有限公司；TMS-Pro質構儀、MilkoScanFT120乳品成分快速分析儀：美國FTC公司；LDZ5-2型臺式低速離心機：北京京立離心機有限公司；XB.K.25 0.10 mm 1/400 mm2型血球計數板：上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水牛乳豆乳霉菌混合干酪制作工藝流程

1.3.2 水牛乳豆乳干酪感官評定

根據農業部NY 478—2002《軟質干酪標準》[6]及成熟軟質干酪評分標準[1]，從滋氣味、組織狀態、外型、色澤等指標評定水牛乳豆乳霉菌干酪品質，總分為100分，品評員8名。水牛乳豆乳干酪感官評定標準見表1。

表1 水牛乳豆乳干酪感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of buffalo milk and soybean milk mixed cheese

1.3.2 菌種活化

將雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）活化后傳兩代[7]，并用茄形瓶擴大培養，分別制成1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL四個不同濃度的霉菌孢子懸液備用。

1.3.3 水牛乳標準化及混入豆奶

用牛奶分離機分離出奶油和脫脂水牛奶，按蛋白（P）/脂肪（F）=0.60～0.65，再與豆乳混合，制備成四種分別含0、5%、10%、15%豆奶的水牛乳、豆乳混合原料乳以備用。

1.3.4 霉菌孢子計數

霉菌孢子按血球板計數，霉菌孢子計算公式如下：細胞個數（CFU/mL）＝80個小方格細胞總數/80×400×10 000×稀釋倍數

1.3.5 水分測定

采用烘干法進行測定[8]。

1.3.6 蛋白的測定

準確稱取1 g左右研磨均勻的干酪，加入催化劑（硫酸鉀、硫酸銅）及10 mL硫酸，加入凱氏消化爐中消化，然后進行凱氏全自動定氮儀測定[9]。

1.3.7 游離脂肪酸測定

采用GB/T5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》中方法測定[10]。

1.3.8 可溶性氮的測定

可溶性氮參照參考文獻[11]中的方法進行測定。

1.3.9 干酪質構的測定

用美國FTC-質構儀進行干酪質構分析（texture profile analysis，TPA）[12]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 豆乳添加量對干酪品質的影響

由于雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）主要是產酸性蛋白酶[13]，用于豆類發酵。本試驗考慮在水牛乳中添加一定比例的豆乳，分別選取0、5%、10%、15%、20%4種添加量來制作毛霉水牛乳、豆乳混合表面成熟干酪，后續觀察霉菌在干酪表面生長情況，并于20 d時對干酪進行感官評定，結果見表2。

表2 不同豆乳添加量的霉菌干酪感官質量及霉菌生長情況Table 2 Effect of different soybean milk addition on sensory quality of mould-ripped cheese and mould growth

由表2可知，隨著豆漿添加量的增加，水牛乳、豆乳干酪的感官評分也有所提高，并在豆乳添加量為15%時達到最高（95分），霉菌在干酪表面生長良好，無雜菌。若將豆乳添加量增加到20%，毛霉菌在干酪表面生長迅速，毛霉老化較快，干酪表面呈現黃褐色，質地較硬，口感略有苦味，水牛乳豆乳干酪特有的奶香味較淡，影響其感官品質，因此選擇豆乳的添加量為15%。

2.1.2 程序升溫攪拌對干酪品質的影響

干酪凝乳切割后，以30℃為升溫起點，以1℃/4 min為升溫攪拌時間，加凝乳酶、發酵劑之后調pH值為6.0，促使凝塊收縮及乳清滲出，分別升溫至36℃、39℃、42℃、45℃，持續攪拌維持10 min，以成熟期為20 d的干酪作為最終樣品，進行感官評定，pH 4.6可溶性氮（soluble nitrogen，SN），12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）可溶性氮等指標測定結果見表3。

表3 霉菌干酪在不同程序升溫下的理化指標及感官評分Table 3 Effect of different programmed temperature on physical and chemical index and sensory evaluation of mould cheese

由表3可知，程序升溫至39℃時，干酪產率達19.2%，pH 4.6、12%TCA可溶性氮含量較高，水分、蛋白質及感官評分等綜合指標較較佳。當程序升溫至36℃和42℃時，干酪的pH 4.6和12%TCA這兩種可溶性氮含量較低，而當程序升溫至45℃時，干酪產率和感官指標均不太理想。因此，程序升溫至39℃為宜。

2.1.3 加鹽量對干酪品質的影響

加鹽可進一步促進乳清排放，也可以抑制部分腐敗微生物及病原體的生長，試驗采取在凝乳切割后，即排乳清前先加鹽2%，待干酪胚成型后再鹽漬相結合的二次加鹽法，鹽漬時分別設置食鹽8%、12%、18%三個質量分數，溫度為16～18℃，時間為120 min[14]，考察對干酪品質的影響，結果見表4。

表4 鹽漬濃度對干酪品質的影響Table 4 Effect of different saline concentration on cheese quality

由表4可知，通過評價霉菌長勢和最終干酪口感，食鹽質量分數為12%時，霉菌長勢、干酪質地、風味最佳，感官評分最高。

2.1.4 霉菌孢子懸液濃度對干酪品質的影響

分別選取104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL四個不同濃度的霉菌孢子懸液噴灑在干酪表面，放入霉菌培養箱培養，結果見表5。

表5 不同霉菌孢子懸液濃度對干酪品質的影響Table 5 Effect of different mould spore suspension concentration on cheese quality

由表5可知，隨著噴霉孢子濃度的增加，表面霉菌的生長速度會加快，質地也更軟，當噴霉濃度達1×107CFU/mL時，毛霉生長旺盛，干酪質地由軟變硬，游離脂肪酸升高，干酪內部的蛋白和脂肪發生強烈水解，過度成熟，不利于干酪的保質，因此，選用1×106CFU/mL的噴霉濃度為干酪最佳霉菌接種濃度。

2.1.5 成熟時間對干酪品質的影響

將前3 d溫度設為18℃，讓霉菌充分生長，后熟過程將溫度設為13℃，待霉菌完全覆蓋干酪表面后，用錫箔紙包裝，待干酪成熟20 d左右，放入4℃冰箱，分別在噴霉后0 d、10 d、20 d、30 d對干酪進行感官評定并檢測其質構、水分、可溶性氮含量，結果見表6。

表6 不同成熟期干酪的感官評定及質構、水分、可溶性氮含量Table 6 Effect of different maturity on sensory evaluation,structured quality,moisture and soluble nitrogen content of cheese

由表6可知，隨著干酪成熟時間的延長，干酪的pH 4.6和12%TCA兩種SN均顯著增加，這是因為毛霉干酪在成熟過程中，酪蛋白發生強烈水解，可溶性氮的變化情況，基本上就可以反映出干酪的蛋白水解的廣度和深度[15]。干酪的水分含量在開始的10 d內下迅速降了10%。通過對不同成熟時間下干酪的感官評定及質構、可溶性氮、水分等指標的分析，可以確定毛霉豆乳、水牛乳混合表面成熟干酪在成熟30 d后，便可以得到較好的品質。

2.2 正交試驗確定干酪發酵最佳工藝參數

基于上述單因素試驗結果，本研究選擇對毛霉豆乳、水牛乳混合表面成熟干酪影響較為重要的3個因素：程序升溫終點溫度、成熟時間、霉菌孢子液濃度進行3因素3水平L9（33）正交試驗，通過對最終產品感官評分來確定最佳生產工藝參數。正交試驗因素與水平見表7，結果與分析見表8。

表7 干酪發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 7 Factors and levels of orthogonal experiments for cheese fermentation technology optimization

表8 干酪發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for cheese fermentation technology optimization

由表8正交試驗極差分析可知，3個因素對結果的影響分別為終點溫度A＞成熟時間B＞霉菌孢子懸液濃度C，水牛乳豆乳霉菌混合干酪的最佳工藝參數為A3B3C3，即：程序升溫終點溫度為41℃，成熟時間為30 d，霉菌孢子懸液濃度為1×106CFU/mL，按此最佳工藝參數進行驗證試驗后，得到混合干酪的感官評分為95分。

3 結論

本試驗將雅致放射毛霉應用到水牛乳豆乳表面混合發酵干酪中，成熟30 d后就得到良好質地和風味，說明該菌種能用于生產水牛乳豆乳混合干酪；通過單因素和正交試驗對干酪的制備工藝進行了優化，確定了其最佳工藝參數：豆乳添加比例15%，程序升溫至41℃，噴霉孢子懸液濃度1×106CFU/mL，成熟時間為30 d。在此最佳條件下制備的水牛乳豆乳混合霉菌干酪具有霉菌干酪特有的滋氣味，組織狀態、外型、色澤均良好，最終感官評分為95分。

水牛奶作為我國南方地區一種特有的原生態乳制品，具有廣闊的開發前景，將其與豆奶混合，利用雅致放射毛霉優良的發酵特性，制成水牛乳豆乳霉菌混合干酪，并對其工藝參數進行了優化，得到了風味柔和且更適合國人口味的國產干酪新品種，為后續此類干酪產品的開發利用提供了實踐基礎與理論依據。

[1]周海珍.類Camembert干酪的加工工藝與風味物質的研究[D].石河子：石河子大學碩士論文，2009.

[2]郭本恒.干酪[M].北京：化學工業出版社，2004.

[3]汪建明，郭林海，孫囝，等.雅致放射毛霉在干酪中的應用[J].中國食品與發酵工業，2008，34（11）：155-156.158-159.

[4]陳瑋.凝固型綠豆雪蓮果酸奶的研制[J].中國釀造，2009，28（4）：180-181.

[5]李玲，曾慶坤，唐艷，等.一種水牛乳硬質干酪的工藝研究[J].中國乳業，2011（5）：61-62.

[6]郭本恒，張少輝.NY 478—2002軟質干酪[S].北京：中國標準出版社，2002.

[7]何華美，李淑珍，陳丹霞，等.芽孢桿菌混合發酵工藝條件的優化[J].中國釀造，2014，33（4）：57-58.

[8]劉福嶺，戴行鈞.食品物理與化學分析方法[M].北京：中國輕工業出版社，1987.

[9]李寧.幾種蛋白質測定方法的比較[J].陜西農業大學學報：自然科學版，2006（2）：132-134.

[10]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB5413.3—2010.嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[11]YUN J J,KIELY L J.BARBAND D M.Mozzarella cheese.Impact of cooking temperature on chemical composition,proteolysis and functional properties[J].J Dairy Sci,1993,76(12):3664-3673.

[12]KINDSTEDT P S.Effect of salt concentration and freezing on Mozzarella cheese Texture[J].J Dairy Sci,1983,66(2):204-213.

[13]楊立新.雅致放射毛霉蛋白酶的液體發酵生產及應用研究[D].北京：中國農業大學碩士論文，2004.

[14]閏波，劉寧，孟祥晨，等.干酪的生產現狀及主要影響干酪品質的因素[J].中國乳品工業，2004，32（7）：30-33.

[15]孟德勇.霉菌干酪均勻成熟的研究[D].天津：天津科技大學碩士論文，2010.

Processing parameters optimization of buffalo milk and soybean milk cheese usingActinomucor elegans

XIE Fang,ZENG Qingkun*,LI Ling,LIN Bo,TANG Yan,NONG Haoru
(Institute ofBuffalo Research,Chinese AcademyofAgricultural Sciencesand Guangxi ZhuangNationalityAutonomousRegion, Nanning530001,China)

The objective of this study was to improve the quality of buffalo milk and soybean milk mixed cheese.Single factor design and orthogonal design were used for processing parameters optimization of buffalo milk and soybean milk mixed cheese respectively.Actinomucor eleganswas used as a starter.The results showed that the optimum processing parameters for the cheese were as follows:soybean milk 15%,programmed temperature 41℃,mould spores concentration 1×106CFU/ml,maturing time 30 d.Under above optimum conditions,a better quality of mould-ripened cheese products can be obtained.

Actinomucor elegans;buffalo milk;soybean milk;cheese

Q939.97

A

0254-5071（2014）11-0162-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.038

2014-09-23

廣西科技攻關項目（11107005-1A）；廣西水產畜牧獸醫局科技項目（桂漁牧科1204915）

謝芳（1980-），女，研究實習員，本科，研究方向為乳品加工。

*通訊作者：曾慶坤（1968-），男，研究員，碩士，研究方向為食品科學。