接種不同優(yōu)勢腐敗菌的冷藏豬肉中揮發(fā)性物質(zhì)的研究

洪兆鵬，鄒小波，石吉勇，朱瑤迪，黃曉瑋

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

接種不同優(yōu)勢腐敗菌的冷藏豬肉中揮發(fā)性物質(zhì)的研究

洪兆鵬，鄒小波*，石吉勇*，朱瑤迪，黃曉瑋

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

為研究接種不同優(yōu)勢腐敗菌的新鮮豬肉在4℃冷藏中的變化，將梭狀芽孢桿菌、韓國假單胞菌和熱死環(huán)絲菌分別接種到新鮮豬肉上，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)，研究其在儲藏過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)。實驗顯示，不同樣品在48、96、144h貯藏時間下的揮發(fā)性成分有較大差異，隨著冷藏時間的增加，烷烴類物質(zhì)種類及含量均明顯增加；醇類物質(zhì)含量增加而醛類物質(zhì)含量減少；硫氫甲烷、3-甲硫基丙烯等含硫化合物被檢測出，但含量較低；酸類物質(zhì)含量隨貯藏時間的延長而逐漸增加；接種梭狀芽孢桿菌的樣品檢測出了高含量的3-羥基-2-丁酮，接種熱死環(huán)絲菌的樣品出現(xiàn)高含量的3-甲基丁醇。結(jié)果表明，接菌樣品與對照樣品的揮發(fā)性物質(zhì)總含量存在顯著差異（p＜0.05），即上述3種菌種會對冷藏豬肉的揮發(fā)性物質(zhì)總含量產(chǎn)生顯著影響。

豬肉，冷藏，優(yōu)勢菌，頂空固相微萃取（HS-SPME），氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）

豬肉營養(yǎng)豐富，在我國肉類市場的占有率很高，一直是我國肉類消費(fèi)的主題。近些年，隨著國人消費(fèi)觀念的提高，人們更加重視豬肉的安全性問題。豬肉的新鮮度可以綜合反映肉類的營養(yǎng)性和安全性。豬肉的化學(xué)組成主要有水、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及少量的維生素和礦物質(zhì)。在貯藏時，由于組織酶和外界微生物等因素的作用，其新鮮度發(fā)生復(fù)雜的變化，散發(fā)的揮發(fā)性成分也發(fā)生變化。通過對豬肉散發(fā)的揮發(fā)性成分的檢測分析，可評價豬肉的新鮮度。氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）[1]具有客觀、準(zhǔn)確、快捷地評價揮發(fā)性氣體，并且具有重復(fù)性好的特點。固相微萃取技術(shù)（headspace solid phase micro extraction，HS-SPME）是20世紀(jì)90年代以來出現(xiàn)的一種揮發(fā)性物質(zhì)分析技術(shù)[2]，可以和氣相色譜或質(zhì)譜聯(lián)系起來，具有簡單方便、測試快、費(fèi)用低，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體等優(yōu)點[3]，大大加快了分析檢測的速度[4]。近年來已被廣泛應(yīng)用于檢測肉類食品中的揮發(fā)性物質(zhì)[5-8]、農(nóng)產(chǎn)品及食品揮發(fā)成分的分析檢測，如輻照豬肉[9]、冷卻豬肉[10]等揮發(fā)成分的分析。

冷藏肉在放置過程中的腐敗變質(zhì)主要是由于嗜冷性微生物的大量增殖造成的，在冷卻條件下，肉類中的微生物生長會受到影響，但不會被完全抑制。豬肉在冷藏過程中會受溫度、酶、微生物等作用，出現(xiàn)腐敗變質(zhì)，并產(chǎn)生具有異味的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物[11]。冷卻肉上的初始菌相中以韓國假單胞菌、梭狀芽孢桿菌和熱死環(huán)絲菌等為優(yōu)勢菌[12-13]，因而，實驗選用韓國假單胞菌、熱死環(huán)絲菌和梭狀芽孢桿菌作為接種菌種，以HS-SPME-GC-MS技術(shù)觀察不同優(yōu)勢腐敗菌在豬肉冷藏過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)及其變化規(guī)律，以期對擁有不同初始菌相的冷藏豬肉在貯藏過程中腐敗規(guī)律的研究提供一定的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗所用樣品新鮮的豬里脊肉（屠宰后排酸24h）。

手動SPME進(jìn)樣器、5μm CAR/PDMS萃取頭美國Supelco公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀Trace MS，美國Finigon公司；氣相色譜毛細(xì)管色譜柱Agilent公司；頂空瓶（20mL）、電子天平上海天平儀器公司；超聲波清洗器昆山市超聲波儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-276uem6美的冰箱中國美的有限公司；加熱攪拌儀韓國；DB-Wax石英毛細(xì)管柱色譜柱美國安捷倫公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種制備取實驗室中從肉中分離并保存的梭狀芽孢桿菌、韓國假單胞菌和熱死環(huán)絲菌菌株用平板傾注法進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，在20℃條件下培養(yǎng)24h。取一環(huán)菌苔接種于300mL的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～18h，用平板計數(shù)法記錄平板上菌落數(shù)，經(jīng)計算使菌液濃度達(dá)到108CFU/mL，經(jīng)稀釋，確定初始接種量為104CFU/mL，備用[8]。

1.2.2接菌在冷藏環(huán)境下將豬里脊肉置于超凈工作臺，切割成小塊，稱取5.0g，然后在酒精燈火焰上進(jìn)行表面滅菌。滅菌后的樣品用一定量的無菌水清洗表面，清洗液在平板劃線，培養(yǎng)并計數(shù)，計算每塊豬肉的表面細(xì)菌總數(shù)均小于102CFU/g，證明滅菌效果良好。取制備好的各腐敗菌菌液，為制備好的無菌肉塊接種，浸泡時間為10s。接種后瀝干菌液，迅速放入20mL頂空瓶中，蓋上蓋子，貼好標(biāo)簽，立即放置到4℃冷藏室中，待檢測其揮發(fā)性物質(zhì)時取用。

1.2.3樣品貯藏本實驗將未接菌樣品和3種接菌樣品放在4℃條件下貯藏，分別在0、48、96、144h取出樣品，測其揮發(fā)性物質(zhì)成分及含量，每種樣品重復(fù)測定3次，最后結(jié)果取平均值。

1.2.4頂空固相微萃取-氣質(zhì)色譜-質(zhì)譜條件頂空固相微萃取：萃取纖維頭的老化：第一次使用之前，萃取纖維頭按照廠家提供的溫度、時間進(jìn)行老化。以后使用時先于300℃下老化30min，再在250℃下不加樣品做數(shù)次空白，直到解吸空白萃取頭的色譜峰不變后再測樣品。

取出冷藏樣品瓶，置于20℃下平衡10min，然后插入75μm碳分子篩/聚二甲硅氧烷（CAR/PDMS）萃取頭，萃取頭距豬肉樣品相距約1cm，推出萃取頭，在60℃水浴吸附40min。

本實驗采用的氣相色譜毛細(xì)管色譜柱，DBWAX石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），氣質(zhì)聯(lián)用儀的型號為6890N氣相色譜系統(tǒng)，5973N質(zhì)譜系統(tǒng)，70L擴(kuò)散系真空系統(tǒng)，載氣為He，進(jìn)樣口溫度為250℃，流速0.8mL/min。采用兩段式程序升溫：起始溫度為40℃，保持4min；然后以5℃/min升溫至100℃；再以8℃/min升溫至230℃，保持7min[14]。接口溫度為230℃，離子源溫度為200℃，電離方式為EI+，發(fā)射電流為200μA，電子能量70eV，掃描質(zhì)量范圍33～500u，檢測器電壓350V。分析結(jié)果運(yùn)用NIST庫檢索，只分析匹配度（SI）和反匹配度（RSI）均在800以上（最大1000）的物質(zhì)，各化合物的峰面積由系統(tǒng)計算。并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行解譜。

2　結(jié)果與分析

2.1豬肉中揮發(fā)性物質(zhì)含量測定

本實驗采用HS-SPME-GC-MS法采集得到樣品的離子流圖，使用NIST05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配測定樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量。圖1為接種韓國假單胞菌樣品培養(yǎng)144h后得到的GC-MS離子流圖。

圖1　接種韓國假單胞菌冷藏樣品在144h測得的GC-MC離子流圖Fig.1　Total ion current chromatogram of volatile components in chilled pork inoculated by Korea pseudomonas with 144 hours storage

豬肉在儲藏過程中，由于組織酶和外界微生物等作用，其腐敗的情況相差很大，其氣味主要是隨豬肉新鮮度的變化而變化。本實驗采用GC-MS技術(shù)檢測在三種不同優(yōu)勢腐敗菌的條件下豬肉隨貯藏時間的延長其揮發(fā)性物質(zhì)的變化情況。樣品隨著貯藏時間的延長，相繼出現(xiàn)了不同的揮發(fā)性成分。各種豬肉樣品揮發(fā)性物質(zhì)的種類和峰面積見表1。

對照樣品分別在48、96、144h下檢測樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)，48h樣品共檢測出22種揮發(fā)性物質(zhì)，主要為乙醇14.74%、乙酸乙酯4.25%、己醛3.34%；96h樣品檢測出27種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為乙醇19.02%、辛烷5.81%、3-甲基丁醇4.32%；144h后樣品檢測到24種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分有3-甲基丁醇為13.15%，R-2，3-丁二醇4.01%，3-羥基-2-丁酮為11.21%。未接菌樣品在貯藏過程中，己醛、庚醛等醛類物質(zhì)含量明顯降低，己醛含量從15.6%逐漸下降到0.42%，戊烷、己烷等烷烴類化合物開始出現(xiàn)，含量也逐漸增加，烷烴類物質(zhì)總含量由原來的0.94%增加到15.3%，醇類物質(zhì)含量逐漸增加，并成為主要揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為乙醇和3-甲級丁醇，3-羥基-2-丁酮含量增加到

11.21%，并開始出現(xiàn)少量如3-甲硫基丙烯等含硫化合物。實驗中檢測出來較高含量的3-羥基-2-丁酮，可能是某些菌分解葡萄糖而產(chǎn)生的[15]，也可能經(jīng)由微生物產(chǎn)生[16]。圖2為對照樣品在不同時間測得的揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量。

表1　各豬肉樣品在不同冷藏時間主要揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量（%）Table.1　Volatile components in chilled pork dominated spoilage bacteria with different storage time（%）

圖2　對照樣品在不同貯藏時間的揮發(fā)性物質(zhì)及含量Fig.2　Relative contents and volatile components identified in control sample with different storage time

接種梭狀芽孢桿菌的樣品分別在冷藏48、96、144h時用固相微萃取技術(shù)檢測樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)。48h樣品共檢測出21種揮發(fā)性物質(zhì)，主要有乙醇37.45%，2，3-丁二酮6.91%，3-羥基-2-丁酮19.30%，96h樣品共檢測到36種揮發(fā)性物質(zhì)，其中乙醇含量占30.42%，乙酸含量6.18%。該樣品變化較大之處在于乙醇含量隨貯藏時間延長而快速增加，由最初的0.44%增加到37.17%，醇類物質(zhì)總含量也由2.32%增加到44.14%，己醛含量快速下降到0.45%。實驗中檢測出來較高含量的3-羥基-2-丁酮，可能是某些菌分解葡萄糖而產(chǎn)生的[15]，也可能經(jīng)由微生物產(chǎn)生[16]。樣品檢測出種類較多的烷烴類揮發(fā)性物質(zhì)，這類物質(zhì)可能來自于豬肉中脂肪酸的降解[17]，因而隨著冷藏時間的增加，檢測出的烷烴類物質(zhì)種類數(shù)量由原來的2種增多到8種，烷烴類物質(zhì)總含量由0.94%增加到7.04%。48h樣品檢測出來了較高含量的2，3-丁二酮，而2，3-丁二酮是微生物代謝活動的副產(chǎn)物[18]，原因可能是低溫對微生物的抑制是需要時間的，48h內(nèi)微生物活動是慢慢減弱的，到96h和144h時，微生物活動就很弱了，因而產(chǎn)生的2，3-丁二酮含量也較低。酯類化合物中，乙酸乙酯開始出現(xiàn)，含量達(dá)到4.44%，總含量由0%增加到7.05%，并檢測出0.28%的3-甲硫基丙烯。

接種韓國假單胞菌的樣品分別在48、96、144h下用固相微萃取技術(shù)檢測樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)。48h樣品檢測到20種揮發(fā)性物質(zhì)，乙醇增加到13.44%，己醛含量從15.6%降低到1.35%，96h樣品檢測到41種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為辛烷占4.35%，乙醇占30.02%，2-丁酮占4.65%，144h樣品檢測到41種揮發(fā)性物質(zhì)，乙醇27.00%，3-甲基丁醇含量上升到5.85%，乙酸4.54%。3-羥基丁酮是微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，可以發(fā)生氧化反應(yīng)生成2，3-丁二酮，或被還原生成2，3-丁二醇[19]，因而上述三種物質(zhì)之間聯(lián)系緊密。乙酸含量由0.34%上升到4.54%，并出現(xiàn)少量的三甲基丁酸，這樣的小分子酸類物質(zhì)主要是微生物降解糖類物質(zhì)產(chǎn)生的[20]。樣品檢測出硫氫甲烷和3-甲硫基丙烯等含硫揮發(fā)性物質(zhì)，可能為豬肉蛋白質(zhì)分解的典型揮發(fā)成分，雖然含量很少，但說明豬肉已有腐敗的跡象。

接種熱死環(huán)絲菌樣品分別在冷藏48、96、144h后用固相微萃取技術(shù)檢測樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)。48h樣品共檢測到25種揮發(fā)性物質(zhì)，總物質(zhì)的相對百分含量為63.16%，主要為醇類物質(zhì)，尤其是乙醇，占總含量的38.50%，酮類物質(zhì)中主要是3-羥基-2-丁酮，占總含量的10%以上。96h樣品檢測到34種揮發(fā)性物質(zhì)，總物質(zhì)的相對百分含量為82.56%，比48h的樣品高出約30%，其中3-羥基-2-丁酮含量進(jìn)一步增加到19.4%，還檢測出與之關(guān)系密切的2，3-丁二醇和2，3-丁二酮，含量分別為3.38%和1.08%，最高含量的物質(zhì)仍為乙醇，占總含量的23.42%，醇類物質(zhì)含量占到總含量的54.90%。樣品檢測出了硫氫甲烷、甲硫基丙烷和1-甲硫基丙烯，含量都很低，原因可能是樣品處于腐敗初始階段，樣品中的蛋白質(zhì)分解程度較低。

2.2豬肉中揮發(fā)性物質(zhì)總含量分析

隨冷藏時間變化的增加，未接菌樣品和分別接種梭狀芽孢桿菌、韓國假單胞菌和熱死環(huán)絲菌樣品的揮發(fā)性物質(zhì)總含量變化趨勢基本一致。各樣品在不同貯藏時間下的揮發(fā)性物質(zhì)總含量如圖3所示。從冷藏0～96h之間，揮發(fā)性物質(zhì)的百分含量都有很明顯的增加趨勢，冷藏96h后揮發(fā)性物質(zhì)有所降低。在整個冷藏過程中，接種熱死環(huán)絲菌的豬肉樣品產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)含量最高，其次是接種梭狀芽孢桿菌的豬肉樣品、接種韓國假單胞菌樣品。值得注意的是，接種梭狀芽孢桿菌的豬肉樣品在冷藏0～48h間，產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)含量增加是最快的，但在48h后含量增加緩慢，在冷藏96h后含量降低；在整個冷藏過程中，產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)含量高于接種韓國假單胞菌樣品和對照樣品。由于在0h樣品是接種完菌種后立即測定，因而4種樣品測得的揮發(fā)性物質(zhì)總含量差別不明顯，而在0h后，3種接菌樣品的揮發(fā)性物質(zhì)總含量則顯著高于未接菌的對照樣品（p＜0.05）。

圖3　各樣品在不同冷藏時間的揮發(fā)性物質(zhì)含量Fig.3　The total volatile substance in pork with different storage time

3　結(jié)論

本實驗發(fā)現(xiàn)隨著冷藏時間的增加，各樣品的揮發(fā)性成分均發(fā)生明顯變化。結(jié)果顯示，不同樣品在不同冷藏時間的揮發(fā)性成分有明顯不同，隨著冷藏時間的增加，烷烴類物質(zhì)種類顯著增多，含量增加；醇類物質(zhì)含量增加，醛類物質(zhì)含量減少，尤其是乙醇和乙醛，符合微生物ED、HMP發(fā)酵途徑中乙醛被還原生成乙醇的代謝規(guī)律[21]。3種接菌樣品檢測出了含量高于對照樣品的3-羥基-2-丁酮，印證了顧賽麒等[15]關(guān)于3-羥基-2-丁酮可能是微生物產(chǎn)生的結(jié)論。含氮含磷含硫物質(zhì)種類較少，主要有硫氫甲烷、3-甲硫基丙烯等，但含量較低；接種韓國假單胞菌的樣品檢測出了超過總含量30%的乙酸，大幅高于其他樣品；到96h和144h時檢測出了硫氫甲烷、3-甲硫基丙烯等含硫化合物，表面樣品中蛋白質(zhì)已經(jīng)發(fā)生了分解，樣品已發(fā)生腐敗。在4種樣品的揮發(fā)性物質(zhì)總含量上存在顯著差異（p＜0.05）。本實驗檢測冷藏豬肉中不同優(yōu)勢腐敗菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，可以為對冷藏豬肉中優(yōu)勢腐敗菌的進(jìn)一步研究提供一些參考。

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Study on detection of volatile components of chilled pork inoculated by different dominating spoilage bacteria

HONG Zhao-peng，ZOU Xiao-bo*，SHI Ji-yong*，ZHU Yao-di，HUANG Xiao-wei
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

In order to study the spoilage characteristics of dominant spoilage bacteria，Pseudomonas koreensis，Clostridium fusiformis and Brochothrix thermosphacta were respectively inoculated into sterilized pork at the storage temperature of 4℃.Volatile compounds of pork with different storage time were analyzed by headspace solid micro extraction（HS-SPME）.Pork with storage time of 48，96，144h and dominant spoilage bacteria had a significant difference in volatile composition.As the time of cold-storage went on，the content of alkanes rose markedly，pork inoculated with Clostridium fusiformis and Brochothrix thermosphacta provided significantly higher levels of 3-hydroxy-2-Butanone and 3-methyl-Butanol，respectively.Contents of sulfhydryl methane and 3-sulfhydryl propylene were actually low.These results showed that at 0.05 significance level，there was significant difference in total volatile substance between pork inoculated by bacteria and control sample.

pork；cold-storage；dominant spoilage bacteria；headspace solid micro extraction（HS-SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

TS207.3

A

1002-0306（2014）06-0111-05

2013－06－17*通訊聯(lián)系人

洪兆鵬（1988-），男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品、食品無損檢測。

國家自然科學(xué)基金資助項目（60901079）；全國優(yōu)秀博士基金（200968）；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新（CX（11）2028）。