下關生沱茶和熟沱茶成分分析和體外功能性效果比較研究

王 睿，趙 欣

（重慶第二師范學院，生物與化學工程系，重慶400067）

下關生沱茶和熟沱茶成分分析和體外功能性效果比較研究

王 睿，趙 欣*

（重慶第二師范學院，生物與化學工程系，重慶400067）

通過液質聯用（LC-MS）分析，下關生沱茶和熟沱茶里均發現存在12種成分，分別是沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、咖啡因、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素-3-半乳糖甙、山柰酚-3-蕓香糖甙、山柰酚-3-葡萄糖苷、槲皮苷和葉黃素。經過發酵后，在熟沱茶中新發現了二羥基苯酸和山奈酚。同時，熟沱茶的沒食子酸和槲皮苷含量增加。經過體外實驗發現，隨著功能性成分的增加，熟沱茶比生沱茶表現出更好的抗氧化、抗突變和抗癌的效果。

下關沱茶，成分分析，LC-MS，抗氧化，抗癌

沱茶是由優質曬青毛茶經蒸制加工而成的圓錐窩頭狀的緊壓茶，主要產地是云南，而云南沱茶創制于下關，所以云南沱茶又稱下關沱茶[1]。下關沱茶也是普洱茶的一類，又可分為生沱茶和熟沱茶，生沱茶為曬青毛茶直接制成的緊壓茶，熟沱茶為曬青毛茶經過人工渥堆發酵后再制成緊壓茶[2]。普洱熟茶因經過了發酵過程，生成了更多的功效成分，已經被證實比普洱生茶具有更好的降血脂和減緩脂質過氧化的作用[3]。同時，沱茶也已經被證實具有抗氧化作用[4]，作為健康食品可以應用于各類人群。現今國內外還未有對下關沱茶發酵前后成分分析的研究，本文對熟沱茶成分較未發酵的生沱茶發生的變化和體外抗氧化、抗突變和抗癌效果變化之間的關系進行了系統研究，對發酵產生的功能性作用差異進行了比較，為更好的開發下關沱茶這一功能性飲品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沱茶提取物 云南下關沱茶（集團）股份有限公司提供2012年產生沱茶和熟沱茶，生沱茶和熟沱茶為同一批次原料茶制成。沱茶葉粉碎后用20倍80%的甲醇進行提取，反復提取三次后合并提取液，用旋轉蒸發儀蒸干甲醇溶液后得到沱茶的提取物[5]；NaH2PO4·2H2O、FeCl3、三氯乙酸 廣州化學試劑廠；2-硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸、D-Biotin、L-histidine·HCl（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate、NADP、deoxyribose（脫氧核糖） 美國Sigma公司；DMSO 日本純正化學株式會社；RPMI 1640培養液、FBS、trypsin、EDTA、100U/mL Penicillin-Streptomycin

美國Gibco公司；其余化學試劑藥品 均為國產分析純；致突變物：N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG） 美國Aldrich公司；標準菌株：TA100營養缺陷型鼠傷寒沙氏菌 美國Sigma公司；癌細胞：AGS胃癌細胞株（AGS human gastric carcinoma cells）、HT-29結腸癌細胞株（HT-29 human colon carcinoma cells） 韓國細胞株銀行。R-114型旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；LSB75L型高壓蒸氣滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司；WPL-30型恒溫培養箱 江東精密儀器有限公司；UV-1750型紫外分光光度計、LCMS-2020液相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；VS-15CFN型冷凍離心機 韓國Vision科學株式會社；MC096型二氧化碳培養箱 日本三洋電機株式會社；Elx800型酶標儀 美國Bio Tekinstruments公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液質聯用（LC-MS）測定沱茶的成分 色譜柱為Waters Xterra MS C18（2.1mm×150mm，5μm），流動相A為蒸餾水，流動相B為乙腈，A、B流動相均含有0.1%的甲酸，進行梯度洗脫，流速為0.2mL/min，順序為：0～5min，使用0%～40%B（線性梯度）；5～20min，使用40%～80%B（線性梯度）；20～25min，使用80～100% B（線性漸變）；25～30min，100%B，掃描范圍100～1000m/z。通過比對MS/MS譜庫，檢索沱茶提取物內所含物質的結構[6]。

1.2.2 羥基自由基清除能力測定 將6mol/L濃度的deoxyribose（脫氧核糖）溶液0.2mL，pH7.4的磷酸鈉緩沖溶液0.2mL，400mmol/L濃度的FeCl3溶液0.2mL，400mmol/L濃度的FeSO4-EDTA溶液0.2mL，3mol/L濃度的H2O2溶液0.2mL，400mmol/L濃度的抗壞血酸溶液0.2mL和0.2mL沱茶提取物溶液混合，在37℃水浴中放置60min，再加入1mL的三氯乙酸，1mL的2-硫代巴比妥酸，混合溶液在90℃水浴中煮沸20～25min后在532nm處測定吸光度，計算清除自由基能力[7]。

1.2.3 DPPH自由基清除能力測定 將100μL不同濃度沱茶提取物溶液和60μL、0.15mmol/L的DPPH試劑混勻后加入96孔板中室溫下避光放置30min，再在540nm波長下測定光度值。測得的OD數值按公式計算：清除DPPH自由基能力（%）=[（對照值-對照空白值）-（樣品值-樣品空白值）]×100/（對照值-對照空白值）[8]，對照組為沒有加入樣品孔，空白組為加入樣品但沒有加入DPPH試劑孔。

1.2.4 Ames抗突變實驗 沱茶提取物設兩個實驗劑量組（1.25、2.5mg/皿）、自發回變組（加入濃度為1～2× 109個/mL的TA100菌株0.1mL，不加入致突變物）和對照組（加入TA100菌株和致突變物（MNNG）50μL），每組設3個平行皿。在樣品實驗組的滅菌試管中加入磷酸鹽緩沖液、濃度為1～2×109個/mL的培養12h后的TA100菌株0.1mL、樣品物質提取物溶液50μL和致突變物（MNNG）50μL。輕微振蕩后37℃下放置30min后加入頂層培養基2mL混合，再倒在底層培養基上，37℃培養48h后進行平板計數計算結果。抑制率（%）=[（對照組菌落數-樣品處理組菌落數）/（對照組菌落數-自發回變組菌落數）]×100[9]。

1.2.5 MMT法測定沱茶提取物的體外癌細胞增值抑制效果 將體外培養的AGS人胃癌細胞和HT-29人結腸癌細胞復蘇后接種在含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養液中，將癌細胞放置在培養箱中以5%的CO2、37℃條件下培養，每周更換培養液2～3次并進行傳代培養一次。按每孔200μL將含癌細胞培養液接種于96孔培養板，培養液的癌細胞濃度為1×104個/mL。然后將96孔培養板放入培養箱中繼續培養24h。吸出96孔板中各孔的培養液，樣品組各孔中加入沱茶提取物的培養液200μL，空白組各孔中加入新培養液200μL。再經過48h培養后，再次吸出各孔內上清液，各孔再加入200μL濃度5mg/mL的MTT試劑后繼續培養4h后吸出各孔內的上清液，在每孔中加入200μL的DMSO后避光振蕩30min，用酶標儀在540nm波長下測定各孔OD值，按公式：抑制率（%）=[（空白孔OD值-樣品孔OD值）/空白孔OD值]×100計算細胞增殖抑制率[10]。

1.3 數據統計

使用SAS統計軟件對所得到數據采用one-way ANOVA法分析數據結果是否存在差異性（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 下關生沱茶和熟沱茶成分的比較

通過LC-MS分析，通過MS/M分解圖中各樣品質譜圖（圖1）和對照標準品比對，觀察到在生沱茶含有沒食子酸（1.70min，m/z169）、表沒食子兒茶素（9.10min，m/z305）、兒茶素（9.30min，m/z289）、咖啡因（9.62min，m/z195）、表兒茶素（10.73min，m/z289）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（10.87min，m/z457）、表兒茶素沒食子酸酯（12.51min，m/z441）、槲皮素-3-半乳糖甙（12.74min，m/z463）、山柰酚-3-蕓香糖甙（13.24min，m/z593）、山柰酚-3-葡萄糖苷（13.51min，m/z447）、槲皮苷（15.39min，m/z301）和葉黃素（25.09min，m/z568）這十二種化合物（圖2A）。經過發酵后在熟沱茶中除了生沱茶中出現的十二種化合物外還出現了兩種新的化合物，為二羥基苯酸（3.43min，m/z153）和山奈酚（17.37min，m/z285），另外經過發酵后熟沱茶中的沒食子酸、二羥基苯酸、槲皮苷、山奈酚和兩種未知成分的含量較生沱茶明顯提高，表沒食子兒茶素沒食子酸酯和一種未知成分的含量大幅度下降，含量下降的未知成分有待進一步研究（圖2B，1）。

2.2 下關生沱茶和熟沱茶抗氧化效果的比較

通過測定下關生沱茶和熟沱茶提取物的羥基自由基和DPPH自由基清除能力可以判斷沱茶的抗氧化效果。100、200、500μg/mL三個濃度下，隨著濃度的升高，生沱茶和熟沱茶的羥基自由基和DPPH自由基清除能力均得到提高；在不同實驗濃度下，熟沱茶的清除自由基能力都強于生沱茶（圖3、圖4）。表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯作為茶多酚的四種單體存在形式具有較強的抗氧化效果[9]，沒食子酸和槲皮苷也是具有很強清除自由基能力的化合物[11-12]。沱茶生茶和熟茶都含有這些具有抗氧化物質，特別是茶多酚物質等有效成分使沱茶產生抗氧化效果。山奈酚是一種黃酮醇類物質，也是一種強抗氧化物質[13]，也存在與生沱茶和熟沱茶中，經過發酵中一系列生化反應，熟沱茶中的山奈酚增加，是使熟沱茶具有更強抗氧化性效果的原因之一。同時，經過發酵后，熟沱茶內的原有的抗氧化成分含量增加并且生成了新的抗氧化物質，進一步提高了沱茶的抗氧化作用。有研究表明，通過SD大鼠高脂模型對云南普洱茶體內抗氧化性研究中，普洱熟茶表現出比普洱生茶更好的抗氧化作用[14]，沱茶的原料和生產方式都和普洱茶十分接近，本研究得出的熟沱茶具有更好抗氧化性的結果也與之相同。

圖1 下關熟沱茶質譜和MS/MS分解圖中重要的14個峰圖Fig.1 Mass spectra and MS/MS fragmentation patterns of 14 important peaks of Xiaguan ripe bowl tea

圖2 下關沱茶的HPLC-PDA色譜圖（200～600nm）Fig.2 HPLC-PDA chromatogram（200～600nm）for Xiaguan bowl tea

圖3 下關沱茶提取物的羥基自由基清除效果Fig.3 Effect of Xiaguan bowl tea extracts in hydroxyl radical（OH）radical scavenging activity

圖4 下關沱茶提取物的DPPH自由基清除效果Fig.4 Effect of Xiaguan bowl tea extracts in DPPH radical scavenging activity

2.3 下關生沱茶和熟沱茶抗突變效果的比較

總體上，下關生沱茶和熟沱茶的提取物對MNNG誘導的TA100菌具有一定的抑制作用。由表1可知，提取物濃度為1.25、2.5mg/皿時生沱茶的抑制率為33.6%和61.2%，熟沱茶對TA100的抑制率比生沱茶有所提高，分別為39.7%和74.2%。茶葉中提取的茶多酚具有很強的抗突變效果，它不僅有促進細胞的DNA損傷修復功能，也有減少誘變劑活化表現抗誘變功能，可以作為去突變劑[15]。生熟沱茶中都含有表沒食子兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯等茶多酚物質，這些茶多酚促進了沱茶的抗突變效果。沒食子酸和槲皮苷已經被證實為具有良好抗突變性的化合物[16-17]，熟沱茶中含有很多的沒食子酸和槲皮苷，進一步促進了沱茶的抗突變效果。食品的抗氧化效果與抗突變效果相對應，抗氧化性強的食品常常也表現出強的抗突變性[18-19]，本研究中熟沱茶抗氧化性強于生沱茶。由此可見，沱茶具有抗突變作用，并且經過發酵的熟沱茶效果更為明顯。

表1 沱茶提取物在致突變物N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG，0.4μg/皿）誘導TAIO0菌株下抗突變效果Table.1 Inhibitory effects of Xiaguan bowl tea extracts against MNNG·induced mutation（0.4μg/disc）of nutrient deficiency strain TA100 of Salmonella typhimurium

2.4 下關生沱茶和熟沱茶癌細胞體外增殖抑制效果的比較

觀察體外癌細胞增殖的變化情況可以從一定程度上判斷食品的抗癌功能性[20]。下關生沱茶和熟沱茶提取物分別對體外生長的AGS胃癌細胞和HT-29結腸癌細胞進行處理，觀察其體外增殖抑制效果。由表2可知，用MTT法觀察不同濃度提取物處理癌細胞后的OD值讀數可以看到樣品處理各組細胞的OD值較對照組OD值明顯下降（p＜0.05），高濃度生沱茶和熟沱茶提取物處理癌細胞后，AGS和HT-29細胞的OD值均低于低濃度處理時，通過計算可得出高濃度樣品處理時具有更高的體外癌細胞生長抑制率，而且熟沱茶提取物對AGS和HT-29癌細胞在兩個濃度上的生長抑制效果均高于生沱茶提取物。

普洱熟茶在發酵過程發生了例如多酚類化合物非酶性自動氧化等反應，茶葉內的物質發生了變化[21]，這些變化使普洱熟茶比生茶具有更好的保健作用，同時發酵過程中的發酵時間、溫度、濕度、微生物種群和數量都是造成這些差異的關鍵因素[22]。體內細胞突變可導致癌癥，防止突變是控制癌癥的一個重要方式[23]。沱茶在發酵過程中含量增加的沒食子酸和槲皮苷增強了熟沱茶的抗突變效果，對癌細胞的作用也隨之加強。本文中下關沱茶作為普洱茶的一種也表現出了類似的結果，除了在抗氧化和抗突變效果上優于生沱茶，在體外抗癌效果上也表現出更強的效果。由成分分析的結果也可以看出隨著成分含量的變化和新的成分在發酵過程的產生，這些成分造成的協同作用也發生了變化，產生了更好的抗癌保健作用，使熟沱茶成為一種更有保健價值的食品。

表2 沱茶提取物對AGS和HT-29癌細胞的體外增值抑制效果Table.2 Growth inhibitory effect of Xiaguan bowl tea extracts on AGS and HT-29 cancer cells

3 結論

從實驗結果可以看出，沱茶中含有十多種有效成分，其中包括多種茶多酚類物質，這些物質是茶葉中重要的功效成分，這些功效成分使生熟沱茶都具有很好的體外抗氧化、抗突變和抗癌效果。熟沱茶由于經過了發酵過程，其化學成分與未發酵的生沱茶也有一定的差異。由于發酵前后沱茶的成分發生改變，發酵前后生沱茶與熟沱茶的抗氧化、抗突變和癌細胞生長抑制作用也出現差異，熟沱茶中產生了沒食子酸和槲皮苷等化合物，這些功能性物質加強了熟沱茶的體外功能性作用，所以熟沱茶具有很好的體外抗氧化、抗突變和抗癌能力。綜合本研究中各項結果可以看出下關沱茶是一種含有多種功能性成分的健康食品，并且經過發酵后得到的熟沱茶的功能性成分更多，具有更高的價值。

[1]張競文，趙欣.下關生沱茶的HT-29人體結腸癌細胞的體外抗癌效果[J].食品工程，2010（1）：37-39.

[2]朱宏濤，楊崇仁，李元，等.普洱茶后發酵過程中微生物的研究進展[J].云南植物研究，2008，30（6）：718-724.

[3]侯艷，肖蓉，徐昆龍，等.普洱茶對實驗大鼠血清中血脂水平和脂質過氧化的影響[J].中國食品學報，2009，9（2）：80-86.

[3]趙瑞，聶淑琴.沱茶的抗氧化和抗肝損害機理[J].國外醫學：中醫中藥分冊，2004，26（4）：234-235.

[4]Lee JS，Kim DH，Liu KH，et al.Identification of flavonoidsusing liquid chromatography with electrospray ionization and ion trap tandem mass spectrometry with an MS/MS library[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry，2005，19（23）：3539-3548.

[5]Zhao X.Hawk tea（Litsea coreana Levl.var.lanuginose）attenuates CCl4-induced hepatic damage in Sprague-Dawley rats [J].Experimental and Therapeutic Medicine，2013，5（2）：555-560.

[6]Kang HS，Chung HY，Jung，JH，et al.Antioxidant effect of Salvia miltiorrhiza[J].Archives of Pharmacal Research，1997，20（5）：496-500.

[7]Banerijee A，Dasgupta N，Bratati D.In vitro study of antioxidant activity of Syzygium cumini fruit[J].Food Chemistry，2005，90（4）：727-733.

[8]趙欣，邵林楠，鄭妍菲.老鷹茶的抗突變和體外抗癌效果[J].食品工程，2008（4）：29-31.

[9]Zhao X，Kim SH，Qi YC，et al.Effects of different kinds of salt in comutagenicity and growth of cancer cells[J].Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition，2012，41（1）：26-32.

[10]王婧，高玉堂.茶多酚抗癌的流行病學研究進展[J].腫瘤，2011，34（6）：553-557.

[11]陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.香椿葉提取物清除DPPH自由基能力的測定方法[J].林產化學與工業，2006，26（3）：69-72.

[12]陸瑞利，胡豐林.亞熱帶部分常見芳香油樹種鮮葉提取物清除自由基的活性研究[J].林產化學與工業，2006，23（2）：51-56.

[13]林智，呂海鵬，崔文銳，等.普洱茶的抗氧化酚類化學成分的研究[J].茶葉科學，2006，26（2）：112-116.

[14]徐湘婷，王鵬，羅紹忠，等.普洱茶預防SD大鼠高脂血癥及抗氧化、保護血管內皮的研究[J].云南農業大學學報，2011，26（2）：260-264.

[15]陳留記，楊賢強.茶提取物和茶多酚抗突變機理研究進展[J].天然產物研究與開發，2001，13（2）：84-89.

[16]李沐涵，殷美琦，馮靖涵，等.沒食子酸抗腫瘤作用研究進展[J].中醫藥信息，2011，28（1）：109-111.

[17]潘憲偉，趙余慶.側柏葉和果實中黃酮類和萜類物質的現代藥學研究進展[J].中草藥，2012，43（8）：1641-1646.

[18]陳美珍，余杰，龍梓潔，等.龍須菜多糖抗突變和清除自由基作用的研究[J].食品科學，2005，26（7）：219-222.

[19]履新.大麥麩皮多酚類提取物抗氧化活性和抗突變性[J].糧食與油脂，2004（6）：9-12.

[20]王剛，趙欣.兩種白茶的抗突變和體外抗癌效果[J].食品科學，2009，30（11）：243-245.

[21]李家華，趙明，胡艷萍，等.普洱茶發酵過程中黃酮醇類物質含量變化的研究[J].西南大學學報：自然科學版，2012，34（2）：59-65.

[22]徐湘婷，王鵬，羅紹忠，等.普洱茶預防SD大鼠高脂血癥及抗氧化、保護血管內皮的研究[J].云南農業大學學報，2011，26（2）：260-264.

[23]李毅民，李申德.癌癥易感基因及其所致腫瘤綜合征的防治策略[J].癌變·畸變·突變，2002，14（3）：202-204.

表11 凝膠時間對內酯豆乳凝膠質構特性的影響（x±SD）Table.11 Effect of gel time on the texture properties of lactone soybean ge（lx±SD）

表12 凝膠時間對內酯牛乳凝膠的質構特性的影響（x±SD）Table.12 Effect of gel time on the texture properties of lactone milk ge（lx±SD）

參考文獻

[1]張海悅，焦萬龍，郭鑭.高纖維內酯豆腐的研制[J].食品科技，2004（3）：26-28.

[2]于濱，王喜波.糖類對內酯豆腐質構的影響[J].中國糧油學報，2012，27（7）：22-25.

[3]王雪，喬君，劉海波.豆漿加熱程度對內酯凝膠強度的影響

[J].農產品加工·學刊，2008（7）：106-108.

[4]金嫘，李新華，宿哲然.牛奶內酯豆腐的研制[J].糧油食品科技，2006，14（3）：29-30.

[5]李里特，劉志勝.加工條件對豆腐凝膠物品質的影響[J].食品科學，2000（5）：26-29.

[6]金嫘，李新華，徐亞平，等.葡萄糖酸-δ-內酯（GDL）對牛乳的凝固及其影響因素的研究[J].食品與發酵工業，2006，32（8）：115-118.

Comparative study on component analysis and in vitro functional effects of Xiaguan raw and ripe bowl tea

WANG Rui，ZHAO Xin*
（Department of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067，China）

By LC-MS analysis，twelve kinds of components were found in both Xiaguan raw and ripe bowl tea，they weregallic acid，epigallocatechin，catechin，caffeine，epicatechin，epigallocatechin gallate，epicatechin gallate，quercetin-3-galactoside，kaempferol-3-rutinoside，kaempferol-3-glucoside，quercetin，and lutein.After fermentation，resorcylic acid and kaempferol were only found in ripe Xiaguan bowl tea，and the gallic acid and quercetin concentrations were increased in ripe Xiaguan bowl tea.By the functional components increasing，ripe Xiaguan bowl tea showed the better antioxidant，antimutagenicity and anticancer effects than raw Xiaguan bowl tea in using in vitro experiments.

Xiaguan bowl tea；component analysis；LC-MS；antioxidant；anticancer

TS201.1

A

1002-0306（2014）06-0150-06

2013－07－17 *通訊聯系人

王睿（1982-），男，碩士研究生，講師，研究方向：食品加工及工程化。

重慶高校創新團隊建設計劃資助項目（KJTD201325）。