酒酒球菌在青梅汁中的生長及蘋果酸乳酸發酵特性的研究

何翠嬋，熊 犍，葉 君，林偉鋒，陳 中

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

酒酒球菌在青梅汁中的生長及蘋果酸乳酸發酵特性的研究

何翠嬋，熊 犍，葉 君，林偉鋒*，陳 中

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

以青梅汁為原料，利用酒酒球菌的蘋果酸-乳酸發酵（MLF）對青梅汁進行生物降酸的研究。結果表明：接種量為2.0×108CFU/mL，青梅汁的pH≥3.4時，MLF能正常進行，并使樣品的酸度降低61.35%以上；接種量為2.6×107CFU/mL時，青梅汁的pH為3.6才能觸發MLF，樣品的酸度降低了77.60%；接種量為2.3×108CFU/mL，在pH3.6和4.0的青梅汁中，添加1.0g/100g的葡萄糖的樣品，與不添加葡萄糖的樣品相比，其酸度分別降低了27.04%和34.63%；在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，酒酒球菌使體系酸度降低了26.40%，證實酒酒球菌可利用檸檬酸作為碳源，進行MLF。

青梅，酒酒球菌，蘋果酸乳酸發酵，降酸

蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒生產尤其是優質干紅葡萄酒釀造的一種主要生物降酸方法。它是指L-蘋果酸在乳酸菌的作用下發生脫羧反應，生成L-乳酸并釋放出CO2的過程，二元酸轉變成一元酸，從而降低酒的酸度，也稱為二次發酵或次級發酵[1-3]。自然條件能夠引發MLF的四個乳酸菌種屬是酒球菌屬（Oenococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和乳桿菌屬（Lactobacillus）[4]。其中，酒球菌屬的酒酒球菌對酒精和低pH具有較高的耐受性，是自然誘發MLF的主要啟動者和完成者，也是目前最主要的商業MLF發酵劑[4-6]。通過酒酒球菌的MLF，可以降低果酒的酸澀和粗糙感，使之柔和、圓潤，同時MLF的代謝產物如乙偶姻、雙乙酰、2，3-丁二醇等能改善口味，增加香氣，提高葡萄酒的生物穩定性和品質[4，7-8]。

青梅含有多種天然有機酸，包括檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸等[9-10]。目前，對青梅汁降酸的研究僅限于化學降酸法[11-12]，該方法降酸效果顯著，但會影響酒體的口感、色澤以及帶來失光、混濁等不穩定現象[13]。關于應用生物降酸法對青梅汁進行降酸的研究還未見報道。

本文將酒酒球菌應用于青梅汁中，研究了接種量、葡萄糖含量及青梅汁的初始pH對其降酸的影響及其在青梅汁中的消長規律，為青梅汁生物降酸的實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青梅汁 由青梅果肉與水按料液比1∶1混合打漿制備，pH為2.9，總酸含量為1.91g/100g；酒酒球菌6066（Oenococcus oeni） 中國工業微生物菌種保藏管理中心；NaHCO3食品級，市售；NaOH 國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液0.10mol/L，pH為3.6；其他試劑 均為分析純；活化培養基 胰蛋白棟20.0g，蛋白棟5.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖5.0g，吐溫80 0.05g，番茄汁250.0mL，蒸餾水750.0mL，pH5.5，1.05kg/cm2滅菌15min，配制固體培養基時添加瓊脂20.0g。

pHS-25數顯pH計 上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-ECU超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；YX-280D滅菌鍋 合肥華泰醫療設備有限公司；GHP-9270隔水式培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備 在液體培養基中，按質量分數接入10%的菌種，于25℃下活化培養3d，按平板菌落計數法測得其活菌數約為2×109CFU/mL，備用。

1.2.2 工藝流程 青梅汁→調節pH（1.0mol/L NaHCO3溶液）→滅菌（121℃，20min）→冷卻→接種→發酵（發酵溫度25℃）→產品。

1.2.3 實驗設計

1.2.3.1 pH對MLF的影響 用NaHCO3溶液調整青梅汁的初始pH為2.9、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0進行發酵，接種量為2.0×108CFU/mL。每隔一定時間取樣檢測菌量，測定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發酵終點。

1.2.3.2 接種量對MLF的影響 將青梅汁（pH3.6）在2.6×107、2.6×108、7.8×108CFU/mL的接種量條件下進行發酵。每隔一定時間取樣檢測菌量，測定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發酵終點。

1.2.3.3 葡萄糖含量對MLF的影響 在青梅汁（pH3.6和pH4.0）中，分別添加0、1.0g/100g的葡萄糖進行發酵，接種量為2.3×108CFU/mL。每隔一定時間取樣檢測菌量，測定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發酵終點。

1.2.3.4 檸檬酸緩沖液對MLF的影響 將青梅汁和檸檬酸緩沖液（pH3.6）在接種量為2.6×108CFU/mL的條件下進行發酵。每隔一定時間取樣檢測菌量，測定pH和總酸，以青梅汁的酸度降到最低值為發酵終點。

1.2.3 測定方法 總酸：采用GB/T 15038-2006電位滴定法（以蘋果酸計）；活菌數的測定：采用GB/T 4789.35平板菌落計數法。

1.2.4 降酸率 降酸率（%）=（發酵前果汁酸度-發酵后果汁酸度）/發酵前果汁酸度×100。

2 結果與討論

2.1 pH對酒酒球菌在青梅汁中的生長及MLF的影響

由圖1可知，樣品酸度的降低幅度及速率與樣品的初始pH有關，pH越大，MLF的降酸速率越快；當樣品的初始pH≤3.2時，酒酒球菌難以發生MLF；當pH≥3.4時，菌體能正常觸發MLF；當樣品的初始pH在3.4～4.0的范圍內，其酸度的降低幅度沒有明顯的差異，分別為0.98、1.01、0.97、0.94g/100g（p＜0.05），相應的降酸率為61.35%、69.64%、75.53%、78.80%。

圖1 pH對酒酒球菌降酸的影響Fig.1 Influence of pH on the deacidification of Oenococcus oeni

由圖2可知，樣品初始pH的高低直接影響著菌體細胞的生長，當樣品的pH低于3.2時，菌體細胞的生物量隨發酵時間的增加呈下降的趨勢；而當樣品的pH高于3.4時，菌體細胞的生物量隨發酵時間的增加呈先上升后下降的趨勢，且總體來看，pH越大時，菌體的存活率越高。

圖2 pH對酒酒球菌生長的影響Fig.2 Influence of pH on the growth of Oenococcus oeni

綜上所述，當樣品的pH≤3.2時，會抑制菌體細胞的生長繁殖，難以發生MLF。因此，為了保證MLF的正常進行，應適當調整樣品的初始pH，使之達到3.4以上。

圖3 接種量對酒酒球菌降酸的影響Fig.3 Influence of inoculation amount on the deacidification of Oenococcus oeni

2.2 接種量對酒酒球菌在青梅汁中的生長及MLF的影響

由圖3可知，添加不同接種量的青梅汁，在MLF過程中，其pH呈上升趨勢，而酸度呈快速下降的趨勢；接種量越大，發酵速率越快，發酵周期越短，但樣品的最終降酸幅度越低。接種量為2.6×107CFU/mL的樣品，在0～48h內，菌體降酸速率緩慢；48～192h里，樣品的降酸速率最快；發酵結束后，青梅汁的酸度下降了1.13g/100g，降酸率為77.60%，pH上升了1.1個單位。而接種量為2.6×108CFU/mL的樣品，其酸度下降了1.02g/100g，降酸率為70.05%。

如圖4所示，青梅汁中的菌體生物量總體呈先上升后下降的趨勢，發酵結束后，菌體數量總體維持在2×108CFU/mL中；在發酵前期，接種量越小，菌體細胞增長的速率越快；在發酵后期，接種量越大，菌體細胞的死亡率越大。這是因為接種量越大，單位體積內菌體生物量越多，青梅汁中的營養物質不足于維持菌體細胞生長繁殖的需要，從而導致菌體細胞大量死亡。

圖4 接種量對酒酒球菌生長的影響Fig.4 Influence of inoculation amount on the growth of Oenococcus oeni

綜上所述，接種量直接影響著酒酒球菌的降酸幅度及其在青梅汁中的生長繁殖。接種量越大，對青梅汁的降酸效果具有抑制作用。因此，在青梅汁中，以2.6×107CFU/mL的菌體生物量接入酒酒球菌后，能發生MLF，從而對青梅汁進行生物降酸。

2.3 葡萄糖含量對酒酒球菌在青梅汁中的生長及MLF的影響

由圖5可知，在相同pH的青梅汁體系中，在發酵的前48h里，樣品的降酸速率幾乎是一致的，這是因為MLF先進行蘋果酸代謝，其代謝的速率與樣品的含糖量無關；但在發酵的后期，不添加葡萄糖的樣品，酒酒球菌的MLF速率及降酸幅度明顯高于添加了1.0g/100g葡萄糖的樣品。而在不同pH的青梅汁體系（pH3.6和4.0）中，發酵結束后，不添加葡萄糖的樣品，其酸度分別降低了0.95、0.99g/100g，而添加了1.0g/100g葡萄糖的樣品，其酸度僅降低了0.56、0.57g/100g，降酸率分別下降了27.04%和34.63%。

圖5 葡萄糖含量對酒酒球菌降酸的影響Fig.5 Influence of glucose content on the deacidification of Oenococcus oeni

由圖6可知，在所有青梅汁體系中，隨著發酵時間的增加，菌體生物量均呈先上升后下降的趨勢，發酵后期，菌體死亡速率明顯加快，這與菌體自溶有關；pH相同時，菌體在添加了葡萄糖的青梅汁體系中，其生長趨勢明顯加快，這是因為菌體有足夠可利用的碳源，對其生長繁殖有促進作用。

圖6 葡萄糖含量對酒酒球菌生長的影響Fig.6 Influence of glucose content on the growth of Oenococcus oeni

綜上所述，在青梅汁中添加1.0g/100g的葡萄糖，對酒酒球菌的生長具有促進作用，但會抑制MLF的進行，影響降酸效果。這有兩個方面的原因，一是酒酒球菌在葡萄糖含量較高的青梅汁中先進行葡萄糖代謝，再進行檸檬酸代謝；其次，酒酒球菌葡萄糖代謝的代謝產物抑制了有機酸代謝的進程。

圖7 酒酒球菌在緩沖液和青梅汁中的降酸效果Fig.7 Effect of deacidification on the buffer solution and plum juice by Oenococcus oeni

2.4 酒酒球菌在青梅汁和檸檬酸緩沖液中的生長及MLF的作用

由圖7可知，酒酒球菌在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和青梅汁中，均能發生MLF，但在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，酒酒球菌降酸的速率較慢，降酸幅度小。發酵192h后，青梅汁的酸度已降到最低值，為0.44g/100g，降低了1.01g/100g，降酸率達到了69.64%，pH上升了1.1個單位；而緩沖液的酸度還在緩慢的下降，發酵結束后，其總酸含量由初始的1.43g/100g降低到了1.05g/100g，降酸率為26.40%，pH上升了0.3個單位。

由圖8可知，在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，酒酒球菌的菌體生物量隨發酵時間的增加呈下降的趨勢，發酵結束后，細菌的存活率為4.11%；這是因為緩沖體系中缺乏菌體生長繁殖所必需的營養物質，從而導致菌體的大量死亡。而在青梅汁中，菌體生物量隨發酵時間的增加先呈緩慢增加再呈緩慢下降的趨勢，其總體維持在2×108～7×108CFU/mL中。

圖8 酒酒球菌在緩沖液及青梅汁中的生長狀況Fig.8 The growth of Oenococcus oeni in the buffer solution and plum juice

綜上所述，酒酒球菌能單獨利用檸檬酸作為碳源，從而啟動MLF。與單一的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系相比，酒酒球菌在復雜的青梅汁體系中的降酸速率快，降酸幅度大；這是因為青梅汁的營養成分能滿足菌體的生長繁殖，當菌體達到一定的生物量時，才能發生MLF，從而起到降酸的作用。

3 結論

本實驗考察了酒酒球菌的接種量、葡萄糖、pH對青梅汁生物降酸的影響。在本實驗條件下，得出的結論如下：

3.1 酒酒球菌的接種量為2.0×108CFU/mL時，青梅汁的初始pH≤3.2，酒酒球菌不能引發MLF，而當其pH≥3.4時，菌體均可引發MLF。

3.2 pH為3.6時，酒酒球菌的接種量為2.6×107CFU/mL，能引發MLF，青梅汁的降酸率達到77.60%。

3.3 酒酒球菌接種量為2.3×108CFU/mL，在pH為3.6和4.0的青梅汁中，分別添加1.0g/100g的葡萄糖，會抑制體系MLF的進行。

3.4 在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系中，酒酒球菌能大幅度降低體系的酸度，說明其可利用檸檬酸作為碳源，進行MLF。

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Study on growth and malolactic fermentation characteristics of Oenococcus oeni in plum juice

HE Cui-chan，XIONG Jian，YE Jun，LIN Wei-feng*，CHEN Zhong
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Plum juice was used as material and Oenococcus oeni was used as strain for malolactic fermentation（MLF）to reduce acids in juice.The results were as follows：when the inoculation amount was 2.0×108CFU/mL，the pH was equal or greater than 3.4，the MLF proceeded normally and the acidity of plum juice was reduced by more than 61.35%.When the inoculation amount was 2.6×107CFU/mL and the pH was 3.6，the MLF could perform and the acidity of plum juice was reduced by 77.60%.When the inoculation amount was 2.3×108CFU/mL and the pH were 3.6 and 4.0，compared with the sample without adding glucose，the acidity of plum juice reduced by 27.04%and 34.63%respectively with 1.0g/100g glucose.In sodium citrates buffer system，the acidity reduced by 26.40%，it was proved that Oenococcus oeni could use citric acid as carbon resource to run of MLF.

plum；Oenococcus oeni；MLF；deacidification

TS201.3

A

1002-0306（2014）06-0177-04

2013－07－22 *通訊聯系人

何翠嬋（1987-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

廣東省教育部產學研結合項目（2011B090400311）。