酶解制備玉米寡肽的研究

黃 薇，宋永康，*，田寶玉，余 華

（1.福建省農業科學院中心實驗室/福建省精密儀器農業測試重點實驗室，福建福州350003；2.福建師范大學生命科學學院/工業微生物教育部工程研究中心，福建福州350108）

酶解制備玉米寡肽的研究

黃 薇1，宋永康1，*，田寶玉2，余 華1

（1.福建省農業科學院中心實驗室/福建省精密儀器農業測試重點實驗室，福建福州350003；2.福建師范大學生命科學學院/工業微生物教育部工程研究中心，福建福州350108）

為了高效制備玉米寡肽，本實驗對玉米蛋白粉進行超聲預處理，以寡肽得率為評價指標，采用復合蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6種蛋白酶對其進行水解，篩選出堿性蛋白酶為制備玉米寡肽的最適水解用酶。通過單因素實驗和響應面分析確定制備玉米寡肽的最適工藝條件為：加酶量2660U/g、底物濃度8.0g/100mL、反應溫度57.0℃、反應pH為9.0、反應時間3h。在該條件下制備的玉米酶解產物的寡肽得率為34.34%± 0.22%，與理論預測值的相對誤差在±1%以內。

玉米蛋白粉，寡肽得率，蛋白酶篩選，響應面分析

運用生物催化技術將低值植物蛋白資源進行高值化、資源化、生態化利用已成為當前食品工業研究的熱點[1-3]。我國是玉米生產消費大國，玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副產物，其蛋白質含量可達50%以上[4]。由于所含的蛋白質缺少賴氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）等人體必需氨基酸，使其在食品中的應用受到很大的限制[5-6]。現代營養研究表明[7-8]，人體對各種氨基酸的利用程度并不完全受單一限制性氨基酸水平的影響，也并不完全遵守營養學經典理論“水桶法則”，相對分子質量低于2ku的寡肽能直接被腸道吸收而被組織利用，并且寡肽具有較強的生物活性和功能特性。研究表明，玉米蛋白粉經蛋白酶酶解后，不僅物理性能得到提高，如高溶解性、低黏度、穩定性好等，其中的一些肽片段還具有抗氧化性、消除疲勞、解酒保肝、降血壓等獨特的生理活性[9-11]。因此，如何利用玉米蛋白粉制備玉米寡肽，是促進玉米加工工業改造和升級急需開展的研究。

在肽產品中，肽含量反映的是產品品質的一個重要的技術指標。目前，檢測肽產品中小分子蛋白含量多采用三氯乙酸（TCA-N）法，其測定結果反映的是分子量小于10ku的可溶性肽；然而在肽產品中寡肽含量（分子量≤2ku）指標才能真實反映肽蛋白的品質[12]。因此，本研究以玉米蛋白粉為原料，提出以寡肽得率為指標，篩選出水解最佳用酶，并對酶解工藝進行優化，制備出高寡肽得率的玉米蛋白酶解產物，旨在為玉米寡肽產業化的提供理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉 粗蛋白含量52.81%，福州科匯生物技術有限公司；單寧酸、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸等試劑 國藥集團化學試劑有限公司；實驗用蛋白酶的性能 見表1。

表1 實驗用蛋白酶的酶活及性質Table.1 Activities and action conditions of several protein enzymes

Kjeltec 2300自動定氮儀 瑞典Foss有限公司；KQ-250DB臺式數控超聲儀 蘇州江東精密儀器有限公司；TD5A-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器、3HA-C恒溫振蕩器常州國華電器有限公司；AL204電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；PHS-3CpH酸度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米蛋白預處理實驗 稱取一定量玉米蛋白粉置于反應杯中，按一定比例加水混勻，用氫氧化鈉調節溶液pH為11，在超聲頻率為40kHz，在超聲功率45W，溫度60℃中超聲30min，作為酶反應的底物溶液。

1.2.2 酶解實驗 取經過預處理的玉米蛋白溶液，用氫氧化鈉或鹽酸調節體系pH至酶的反應pH，加入反應所需的蛋白酶，在酶的反應溫度下進行酶解反應，水解至預定時間后取出的樣品溶液置85℃水浴鍋中滅酶10min，5000r/min離心20min，所得上清液即為玉米蛋白酶解產物，保存在4℃待分析用。

1.2.3 寡肽得率的測定 單寧酸溶蛋白含量的測定：參考DB35/T 1089-2011，利用凱氏定氮法測定出玉米蛋白酶解液經16%單寧酸沉淀后濾液中的蛋白含量，測得的結果即為單寧酸溶蛋白含量。

游離氨基酸含量的測定：參考DB35/T 1089-2011，利用甲醛滴定法，測定出經16%單寧酸沉淀后濾液中的游離氨基酸的含量。

總蛋白含量的測定：參考GB5009.5-2010，利用凱氏定氮法測定出玉米蛋白分的蛋白質含量。

寡肽得率（%）=（單寧酸溶蛋白含量-游離氨基酸含量）/總蛋白含量×100

1.2.4 蛋白酶的篩選 在預處理玉米蛋白溶液的基礎上，分別加入不同蛋白酶2000U/g，在表1所示最適反應溫度和pH的條件下進行水解反應，水解時間6h，每隔1h取樣，測定水解玉米蛋白過程中寡肽得率的動態變化趨勢。

1.2.5 單因素實驗 根據堿性蛋白酶水解玉米蛋白過程中寡肽得率的動態變化結果確定水解時間為3h，研究加酶量、底物濃度、pH、反應溫度對玉米蛋白酶解物產寡肽得率的影響。各因素濃度梯度分別為：加酶量：800、1200、1600、2000、2400、2800、3200、3600、 4000、4400U/g，底物質量濃度：2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0g/100mL，pH：6、7、8、9、10，反應溫度：45、50、55、60、65℃。

1.開發環保能源，提供創業新動力。在能源緊缺、環境污染嚴重的今天，開發新型環保替代能源至關重要。作為大學生創業者，要以保護生態環境為中心，在發展自己事業的同時著重保護環境，積極尋找和開發環保能源，不斷創新，要致力于打造零污染，零排放的安全放心企業。在開發尋找環保能源的同時，不斷引入高科技手段，實現現代互聯模式，為創業提供新途徑，新思路，也為國家環境的保護做出應有貢獻。

1.2.6 響應面實驗設計 根據單因素實驗結果，固定酶解時間3h，反應pH9.0，運用Box-Behnken中心組合實驗設計原理[13]，考慮堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉的加酶量、底物濃度以及反應溫度3個因素對玉米寡肽得率的影響，響應面實驗因素與水平設計見表2。

表2 響應面優化的因素和水平設計Table.2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數據處理

響應面實驗結果采用Design Expert 8.0進行極差和方差分析。

2 結果與分析

圖1 玉米蛋白酶解過程中寡肽得率的變化Fig.1 Dynamic changes in yield of oligo-peptide during hydrolysis of corn gluten meal

2.1 不同蛋白酶酶解產物的寡肽得率分析

不同蛋白酶水解玉米蛋白粉過程的寡肽得率的動態變化趨勢見圖1。從圖1中可知，在同等酶活力條件下，不同蛋白酶水解玉米蛋白的能力具有顯著差異。堿性蛋白酶酶解產物寡肽得率最高，水解3h時寡肽得率可達22.60%，之后趨于平緩；其他五種蛋白酶在作用1h后，寡肽得率基本恒定，水解6h所得寡肽得率的大小分別為復合蛋白酶（13.13%）＞風味蛋白酶（8.87%）＞中性蛋白酶（8.37%）＞胰蛋白酶（6.67%）＞木瓜蛋白酶（4.87%）。

相比其他幾種蛋白酶，堿性蛋白酶在適宜的條件下對玉米蛋白具有較強的生物活性，同時所得酶解產物的寡肽得率最高，在實際生產中比較切實可行，因此選擇堿性蛋白酶作為制備玉米寡肽的水解蛋白酶。

2.2 單因素實驗

2.2.1 加酶量對寡肽得率的影響 在底物濃度10.0g/ 100mL、pH8.0、反應溫度60℃、酶解時間3h的條件下，測定不同加酶量對玉米寡肽得率的影響，結果見圖2。圖2中顯示，在加酶量800～2800U/g范圍中，寡肽得率隨加酶量的增加而上升，當加酶量達到2800U/g時，寡肽得率為28.19%，之后進一步增加酶的用量，寡肽得率變化不明顯，此時酶分子與底物分子接觸達到飽和，轉化效率達到最大。綜合考慮酶解反應過程，較適加酶量在2800U/g左右。

圖2 加酶量對寡肽得率的影響Fig.2 Effect of protease amount on yield of oligo-peptide

2.2.2 底物濃度對寡肽得率的影響 在酶濃度2800U/g、pH8.0、反應溫度60℃的條件下酶解3h，測定不同底物濃度酶解后的玉米寡肽得率，結果見圖3。從圖3中可知，在底物濃度較低時，加大底物濃度，體系寡肽得率不斷增加；當底物濃度達到8.0g/100mL時達到最高值，為29.33%，繼續增加底物濃度，所得寡肽得率出現緩慢下降的趨勢。可能原因是在底物濃度較低時，底物濃度的增加可以加大酶與底物的結合，使得產物增加，但當底物濃度過高，體系流動性較差，不利于蛋白質的充分溶解和分散，使得酶與底物的接觸機會也逐漸降低。綜合考慮，確定底物適宜濃度在8.0g/100mL左右。

圖3 底物濃度對寡肽得率影響Fig.3 Effect of substrate concentration on yield of oligo-peptide

2.2.3 pH對寡肽得率的影響 在底物濃度8.0g/ 100mL、加酶量2800U/g、反應溫度60℃、酶解時間3h的條件下，測定不同pH對玉米寡肽得率的影響，結果見圖4。從圖4中可知，pH在6.0～10.0的范圍內，寡肽得率的變化趨勢為先增大后減小，在pH9.0時達到最高，為31.89%。酶的催化能力與pH密切相關，環境pH能夠影響酶分子的構象和酶與底物的解離狀態，過高或過低均對酶促反應不利，因此選定pH9.0作為水解的適宜pH。

圖4 pH值對寡肽得率的影響Fig.4 Effect of pH value on yield of oligo-peptide

2.2.4 溫度對寡肽得率的影響 在底物濃度8.0g/ 100mL、加酶量2800U/g、pH為9.0、酶解時間3h的條件下，測定不同溫度對玉米寡肽得率的影響，結果見圖5。從實驗結果中可以知，當反應溫度較低（45～55℃）時，體系寡肽得率隨溫度升高而逐漸上升，于55℃時達到最大值34.03%，而當反應溫度較高（55～65℃）時，則體系寡肽得率隨溫度升高而逐漸下降。環境溫度直接影響蛋白酶的酶活力，且在溫度較低時，溫度升高能加劇蛋白質分子的擴散促使反應加快，但當溫度過高時易引起維持酶分子結構次級鍵解體，導致酶失活。故確定較適反應溫度在55℃左右。

圖5 反應溫度對寡肽得率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on yield of oligo-peptide

2.3 酶解工藝條件優化

2.3.1 多元二次回歸方程的建立與分析 在單因素實驗基礎上，選取X1加酶量、X2底物濃度、X3反應溫度為自變量，以Y寡肽得率為響應值，開展N=17的三因素三水平的Box-Behnken的中心組合設計實驗，實驗結果見表3。對實驗數據進行多元回歸擬合，得到寡肽得率擬合回歸方程為：

Y=34.09-0.97X1-0.97X2+1.57X3-0.64X1X2+ 0.18X1X3+0.67X2X3-0.61X12-2.98X22-1.23X32

表3 Box-Behnken設計矩陣和響應數據的實測值與擬合值Table.3 Test scheme and its observation and simulation values in BOX-Behnken design

表4 二次多項模型方差分析表Table.4 Analyse of variance for the regression quadratic model equation of Box-Behnken design

由表4的方差分析可知，所得二次多項模型極顯著（p值＜0.0001），且失擬項檢驗不顯著（p值=0.4092），表明該模型選擇正確；多元相關系數為R2=0.9885，校正決定系數R2Adj=0.9738，表明此回歸模型能解釋97.38%響應值的變異；模型的信噪比（Adeq precision）為27.301（＞4），說明本模型擬合3個因數與響應值之間的關系是可行的。從3個因素對響應值的影響來看，一次項X1、X2、X3對寡肽得率均有極顯著的影響，且影響順序為X3＞X2＞X1，二次項X12、X22、X32以及交互項X1X2、X2X3對寡肽得率影響顯著，二次項X1X3對寡肽得率影響不顯著，這表明響應值的變化比較復雜，各實驗因素對響應值的影響呈二次關系，且3因素之間存在交互作用。

圖6 底物濃度和加酶量交互影響的響應面圖Fig.6 Rresponse surface of mutual-influence for substrate concentration and enzyme concentration on yield of oligo-peptide

圖7 加酶量和反應溫度交互影響的響應面圖Fig.7 Rresponse surface of mutual-influence for enzyme concentration and enzymolysis temperature on yield of oligo-peptide

圖8 底物濃度和反應溫度交互影響的響應面圖Fig.7 Rresponse surface of mutual-influence for substrate concentration and enzymolysis temperature on yield of oligo-peptide

2.3.2 響應面分析與優化 分別將模型中的X1、X2、X3中的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互作用對響應值Y的子模型，根據模型分別繪制響應曲面圖，見圖6～圖8。從圖中可知，固定反應溫度X3=55℃，在X1=2648.64U/g、X2=7.84g/100mL時，寡肽得率達到最大值34.50%；固定底物濃度X2=8.0，在X1=2658.11U/g、X3=56.76℃時，寡肽得率達到最大值34.89%；固定加酶量X1=2800U/g，在X2=7.81、X3= 56.83℃時，寡肽得率達到最大值34.62%，從圖6～圖8中可以看出，除了加酶量外，隨著各因素值的增加，Y值均呈先增大后減小的拋物線變化趨勢。利用Design-Expert8.0軟件對實驗數據進行最優化分析，得到當X1=2659.71U/g、X2=7.96g/100mL、X3=56.74℃時，寡肽得率可以達到最大值34.8947%。

2.3.3 驗證實驗 考慮到成本及實際操作方便，選擇的最優酶解條件為堿性蛋白酶加酶量2660U/g、底物濃度8.0g/100mL、反應溫度57.0℃，依據該條件所得的寡肽得率預測值為34.8851%。為了檢驗模型預測的準確性，在最優酶解條件下水解，做3組平行實驗進行模型驗證，得到實測寡肽得率的結果分別為34.11%、34.38%和34.54%，與預測值的誤差均在±1%以內，表明了所得模型能較好地預測實際酶解情況。

3 結論

3.1 對復合蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等6種商業化蛋白酶酶解玉米蛋白的寡肽得率進行分析。其中堿性蛋白酶相比其他幾種酶，效率較高，能獲得較高的寡肽得率，是制備玉米寡肽的最佳蛋白酶。

3.2 堿性蛋白酶水解玉米蛋白制備寡肽，體系寡肽得率與加酶量、底物濃度及反應溫度顯著相關，方差分析顯示各因素對玉米蛋白酶解產物的寡肽得率的影響順序為：反應溫度＞底物濃度＞加酶量，建立的回歸模型可信。

3.3 根據單因素實驗和響應面分析得到堿性蛋白酶酶解玉米蛋白制備寡肽的較佳工藝條件為：加酶量2660U/g、底物濃度8.0g/100mL、反應溫度57.0℃、反應pH為9.0、反應時間3h。在該條件下制備的玉米酶解產物的寡肽得率為34.34%±0.22%，與理論預測值的相對誤差在±1%以內。

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Enzymatic preparation of corn oligo-peptide

HUANG Wei1，SONG Yong-kang1，*，TIAN Bao-yu2，YU Hua1
（1.Central Laboratory，Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Key Laboratory of Precise Measurement of Agricultural，Fuzhou 350003，China；2.College of Life Sciences/Engineering Research Center of Industrial Microbiology of Ministry of Education，Fujian Normal University，Fuzhou 350108，China）

In order to prepare corn oligo-peptide efficiently，corn gluten meal was pretreated by ultrasonic. Using the yield of oligo-peptide as the evaluation indicator，Alcalase was screened out from the following six kinds of protease-Protamex，Alcalase，Flavourzyme，Protex7L，Trypsin and Papain.Single factor experiment and response surface methodology were used for optimizing the enzymatic hydrolysis conditions in this study.The optimum hydrolysis conditions were designated as enzyme concentration of 2660U/g，substrate concentration 8.0g/100mL，Enzymolysis temperature of 57.0℃，pH 9.0，and enzymolysis time of 3h.Under these conditions，yield of corn oligo-peptide could reached up to 34.34%±0.22%，which coincided with predictive values with the relative error of less than±1%.

corn gluten meal；yield of oligo-peptide；protease screening；response surface methodology

TS210.9

A

1002-0306（2014）06-0202-05

2013－07－31 *通訊聯系人

黃薇（1986-），女，助理研究員，研究方向：食品生物技術。

福建省科技重大專項（2010NZ0002-1）；福建省公益類科研院所基本科研專項（2011R1027-1）。