等離子誘變選育檸檬酸高產菌

劉 燕，楊建松，王 露，王德培

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

等離子誘變選育檸檬酸高產菌

劉 燕，楊建松，王 露，王德培

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

黑曲霉TN09是1株檸檬酸生產菌株．為了進一步提高檸檬酸的生產水平，利用等離子對檸檬酸生產菌黑曲霉TN09進行了誘變．誘變后的孢子懸液涂布玉米液化液平板，35℃培養至72h測量透明圈直徑，以酸解透明圈直徑大于2.2cm、菌落直徑大于0.5cm、其比值大于4.8的菌落作為初篩檸檬酸菌株，然后進行搖瓶復篩獲得了1株遺傳性能穩定的高產菌，與出發菌株(產酸12.46g/dL)相比產酸增幅達到8.67%．

黑曲霉；檸檬酸；等離子誘變

檸檬酸是一種重要的有機酸，在食品、醫藥、化工等領域應用十分廣泛，也是世界上以液體深層發酵方法生產的產量最大的有機酸，2012年世界年產量約為180萬噸．我國是檸檬酸主要生產國，年產量為107萬噸，占世界總產量的61%左右[1–5]．

等離子體是大量相互作用的但仍處于非束縛狀態下的帶電粒子組成的宏觀體系，是與固態、液態、氣態處于同一層次上的物質的第四態．等離子是電離氣體，這些物質能與生物體內的生物大分子(酶或DNA)相互作用，從而引起生物體的死亡或突變．等離子作為一種物理誘變手段，具有快速、低溫、操作簡便、無毒性以及誘變效果好等優點，將等離子體應用于微生物誘變育種還是一個嶄新的技術[6]．

考慮到檸檬酸生產菌種經過幾十年的誘變已經對傳統誘變產生一定的抗性，所以采用了新型誘變方法——等離子誘變，希望獲得產酸高、轉化率高、能耗低、生產成本低的檸檬酸生產菌株．本文的實驗結果對提高檸檬酸的產量與質量、增強我國檸檬酸國際市場競爭力、促進檸檬酸行業的發展有著重要的參考價值．

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergillus niger)TN09，本實驗室保存．

1.2 原料及其預處理

馬鈴薯、玉米粉均由山東日照魯信金禾生化有限公司提供．

玉米液化液制備：玉米粉與水以1∶4的比例混合，攪拌均勻后加熱到70℃，加入耐高溫的α–淀粉酶(0.5kg/t)，保溫10min后加熱到90℃保溫4～5h，碘檢不變色，趁熱經兩層紗布過濾．濾清液冷卻后加水調整總糖到要求的濃度[7–8]．

1.3 儀器設備

ARTP室溫等離子誘變系統(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)，北京思清源生物科技有限公司；G6型迅數全自動菌落分析儀，杭州迅數科技有限公司；JNOECXS212201型顯微鏡，Olympus公司．

1.4 培養基

PDA斜面培養基(g/L)：馬鈴薯的煮汁200，葡萄糖20，瓊脂粉20，121℃滅菌20min．

PDA平板培養基(g/L)：馬鈴薯的煮汁200，葡萄糖20，瓊脂粉15～20，121℃滅菌20min．

玉米液化液平板(g/L)：總糖為6%的玉米液化液，MgSO4·7H2O 1.5，K2HPO43.6，瓊脂粉20，121℃滅菌20min；

液體發酵培養基(g/L)：總糖為18%的玉米液化液121℃滅菌20min．

1.5 培養方法

斜面培養：35℃培養7,d．

搖瓶培養：500mL三角瓶中裝入50mL玉米液化液培養液，121℃滅菌20min，采用活菌計數法接入活孢子濃度為5×104mL–1，搖床轉速330r/min，35℃振蕩培養72h．

1.6 誘變方法

1.6.1 菌種活化

將黑曲霉TN09接入斜面培養基中，置于35℃恒溫培養箱中培養7,d，斜面培養基上長滿孢子．

1.6.2 樣品載片制備

將黑曲霉TN09的新鮮孢子制成孢子懸液后分散均勻，用生理鹽水調節孢子懸液濃度至105～106mL–1．取10μL孢子懸液，將其滴加在滅菌冷卻后的載玻片上．

1.6.3 等離子誘變過程

將載物臺上的載片放置區域紫外滅菌30min．將制得的樣品載片置于載臺上，使載片與射流出口的距離為2mm；打開工作氣體閥門，工作氣體即放電氣體為氦氣；打開外加電源，外加200V、13.56MHz的射頻電壓，此時射流溫度為室溫．樣品進行輻照，輻照時間為80～180s．

1.7 篩選方法

1.7.1 初篩

將經誘變后的孢子用無菌水洗下，涂布于玉米液化液培養基，培養72h后測量透明圈直徑．滿足酸解透明圈直徑大于2.2cm、菌落直徑大于0.5cm、其比值大于4.8的菌落作為初篩檸檬酸菌株，把這些菌落轉接到斜面培養基上進一步篩選．

1.7.2 復篩

從初篩得到的斜面菌株上挑取適量的黑曲霉制備孢子懸液，接入活孢子濃度為5×104mL–1，接種于總糖為18%的玉米發酵液中．500mL三角瓶中裝入50mL培養液，35℃、300r/min振蕩培養72h，并稱量上搖瓶質量m1、下搖瓶質量m2，每株菌設置3個平行度，產酸值取3個平行的平均值．

1.8 分析方法

1.8.1 菌落分析儀觀察

利用全自動菌落分析儀計算菌落直徑、透明圈直徑及其直徑比例．

1.8.2 活菌計數

從PDA斜面上挑取菌塊至50mL帶有玻璃珠的無菌水中，振蕩1h使孢子分散．準確量取1mL菌液，稀釋104倍．準確量取0.5mL稀釋菌液，涂布玉米液化液平板上，每個斜面涂布3個平行．將平板放置于生化培養箱，35℃培養24h，通過全自動菌落分析儀計數取平均值．

1.8.3 黑曲霉菌絲球形態的觀察

在發酵結束時，將發酵液置于顯微鏡下放大10倍觀察黑曲霉菌絲球的形態．

1.8.4 酸度測定

發酵液經紗布過濾后取1mL置于250mL三角瓶中，用0.142,9mol/L NaOH滴定，0.5%酚酞指示劑2滴，以標準溶液滴至淡粉紅色，讀取消耗NaOH標準溶液的體積為V，則總酸含量按照式(1)計算，實際產酸(g/dL)按照式(2)計算．

式中：Y 為總酸含量，以一水檸檬酸計量(g/dL)；c為NaOH標準溶液物質的量濃度(mol/L)；V為NaOH標準溶液消耗體積(mL)[9–10]．

1.8.5 致死率、突變率和誘變菌株產酸增幅的計算

致死率、正突變率、負突變率和誘變菌株產酸增幅分別按照式(3)—式(6)進行計算．

式中：正突變的菌落數為透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑均大于出發菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑的菌落數；負突變的菌落數為透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑均小于出發菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑的菌落數[10]．

2 結果與討論

2.1 玉米液化液平板篩選方法的確定

2.1.1 玉米液化液培養基中檸檬酸質量分數與透明圈大小的關系

在玉米液化液培養基的牛津杯孔洞內各加50μL質量分數為2%、4%、6%、8%、10%、12%的檸檬酸溶液，8h后觀察，可以明顯看到由于檸檬酸擴散所形成的酸解透明圈，如圖1所示．

圖1 在玉米液化液培養基中不同質量分數檸檬酸形成的透明圈Fig. 1 Transparent circle of different concentrations of citric acid formed in the liquid medium of the liquefied corn

平板于35℃擴散一定時間，測定形成透明圈的直徑，計算半徑平方，分別對玉米液化液培養基中檸檬酸質量分數與透明圈直徑、檸檬酸質量分數與透明圈半徑平方的關系作線性關系圖(圖2)，線性相關系數R2分別為0.902和0.929，均大于0.9，表明具有較好的線性關系．

圖2 玉米液化液培養基中檸檬酸質量分數與透明圈直徑或半徑平方的線性關系Fig. 2Linear relationship between the citric acid concentration in the liquid medium of the liquefied corn and the diameter of the transparent circle or radius squared

由圖1和圖2可知，在玉米液化液培養基中，檸檬酸濃度與培養基中形成的酸解透明圈的直徑和半徑的平方均可形成較好的線性關系，而且酸解透明圈清晰可見，不需顯色劑即可準確測量，因此玉米液化液培養基可用于產酸篩選．

2.1.2 黑曲霉TN09在玉米液化液培養基中的生長狀況

將黑曲霉TN09菌株制作孢子懸液，經稀釋分別涂布于多個玉米液化液培養基上，每個平板控制菌落數在30個以內，從24 h開始進行觀察并記錄菌落直徑和透明圈直徑，記錄50個菌落，結果如圖3所示．

圖3 黑曲霉TN09在玉米液化液培養基中生長情況Fig. 3Growth of Aspergillus Niger TN09 in the liquid medium of the liquefied corn

從圖3可看出：隨著時間的增加，黑曲霉TN09菌落直徑和透明圈直徑不斷增加．在36 h時黑曲霉TN09產酸并形成透明圈，并隨時間增加其酸解透明圈直徑變大；在48 h時酸解透明圈直徑為0.8～0.85 cm，菌落直徑為0.2～0.3 cm，其比值為3.0～4.0；72 h時酸解透明圈直徑為2.0～2.2 cm，菌落直徑為0.45～0.5 cm，其比值為4.4～4.8，透明圈直徑與菌落直徑比值達到最大．因此，可在誘變后培養至72 h測量透明圈直徑，以酸解透明圈直徑大于2.2 cm、菌落直徑大于0.5 cm、其比值大于4.8的菌落作為初篩檸檬酸菌株．

2.2 誘變育種

2.2.1 等離子誘變時間的確定

誘變時間的選擇往往以致死率和正突變率為依據：若致死率太高，易產生負突變；若致死率太低，則突變較低．為了確定等離子的誘變時間，對80、100、120、140、160、180 s等離子誘變時間的孢子致死率進行了測定，并通過玉米液化液平板透明圈方法計算正負突變率，結果如圖4所示．

圖4 黑曲霉TN09誘變致死率和正突變率Fig. 4 Curve of the mutagenized death rate and positive mutant rate of Aspergillus niger TN09

由圖4可以看出，以中性活性粒子作為作用粒子的等離子射流輻照待誘變微生物，黑曲霉孢子致死率隨著等離子誘變時間的延長而增加，但在160 s時，致死率有略微下降，誘變時間在140～160s正突變率較大，在160 s時正突變率達到最大，因此選取160 s為誘變時間．

2.2.2 搖瓶復篩產酸

通過玉米液化液平板初篩得到51株菌，將其進行搖瓶產酸實驗，產酸增幅較大的前10株菌產酸結果及其玉米液化液平板初篩所對應的透明圈與菌落直徑比值見表1．

51株菌中，搖瓶產酸值大于出發菌株TN09的菌株共47株，占總數的92.16%，驗證了玉米液化液平板篩選方法的可行性；產酸值大于對照的菌株誘變時間在140～160s的菌株共43株，占總數的84.31%，其中誘變時間為160 s的有31株．將產酸增幅大于5%的14株菌再次進行搖瓶產酸實驗，最終得到產酸增幅大于7%的兩株高產菌TN160s-D-3和TN120s-D-1，其產酸增幅分別為8.67%和7.22%．由于檸檬酸原始生產菌株是經過多次誘變的菌株，對各種誘變手段已具有較高的耐受性，雖然等離子誘變是新型的物理誘變手段，但誘變后產酸增幅也不是過于明顯．

表1 突變株發酵產酸結果Tab. 1 Yield of citric acid through mutation

2.3 遺傳穩定性

為了確保篩選到的高產菌的遺傳穩定性，對TN160s-D-3和TN120s-D-1進行了遺傳穩定性考察，每代實驗過程：高產菌株單菌落—斜面培養—搖瓶發酵測檸檬酸產量．將得到的兩株遺傳穩定性較好的高產菌株TN160s-D-3和TN120s-D-1共傳10代，第2、4、6、8、10代搖瓶發酵，測定結果如圖5所示．

圖5 遺傳穩定性Fig. 5 Genetic stability of the mutants

由圖5可知，突變得到的菌株TN160s-D-3遺傳穩定性比較好．菌株TN160s-D-3在平板培養基上菌落緊湊，邊緣整齊，氣生菌絲短，孢子粗壯，顏色為黑褐色，無退化現象．顯微鏡觀察TN160s-D-3在玉米液化液搖瓶中菌球緊湊，為優良的篩選菌．而TN120s-D-1產酸量則不斷下降，遺傳穩定性很差，平板上的菌落形態逐漸發散，有恢復野生型的跡象．

3 結 論

采用等離子誘變方法對檸檬酸企業生產使用的出發菌株進行誘變．在此過程中，建立玉米液化液平板初篩方法．該方法排除了以往加指示劑觀察透明圈對菌落生長的影響，獲得了1株比對照菌提高8.67%且遺傳性穩定的高產酸菌株TN160s-D-3，并且確定了等離子最佳誘變時間為160 s．由此為進一步的誘變育種工作提供了初篩方法和理論依據，這種誘變方法也可供其他微生物誘變育種時借鑒．

［1］ 王博彥，金其榮. 發酵有機酸生產與應用手冊[M]. 北京：中國輕工業出版社，2000.

［2］ 金其榮，張繼民，徐勤. 有機酸發酵工藝學[M]. 北京：中國輕工業出版社，1989.

［3］ 王旭，禹邦超，賀占魁. 檸檬酸發酵生產概述[J]. 高等函授學報：自然科學版，1997，11(2)：41-48.

［4］ Nierman W C，Pain A，Anderson M J，et al. Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus[J]. Nature，2005，438 (7071)：1151-1156.

［5］ Fillinger S，Chaveroche M K，van Dijck P，et al. Trehalose is required for the acquisition of tolerance to a variety of stresses in the filamentous fungus Aspergillus nidulans[J]. Microbiology，2001，147(7)：1851-1862.

［6］ 邢新會，王立言，趙洪新，等. 一種利用等離子體對微生物進行誘變育種的方法：中國，200810116220.5[P]. 2010–01–13.

［7］ 陳小真，陳惠萍，郭杰炎. 玉米粉原料的檸檬酸發酵初步研究[J]. 工業微生物，2000，30(1)：47–49.

［8］ 朱亨政. 淀粉原料直接發酵生產檸檬酸[J]. 工業微生物，1990，20(4)：20–24.

［9］ 潘濤，周劍，虞龍. 離子注入誘變技術在檸檬酸高產菌選育中的應用[J]. 化學與生物工程，2005(3)：42-44.

［10］ 李文革，彭玲，劉宣承.60Co-γ射線誘變檸檬酸產生菌黑曲霉Co9-6的研究[J]. 激光生物學，1994，3(3)：509–512.

責任編輯：郎婧

Breeding Aspergillus niger for Citric Acid through Plasma Mutation

LIU Yan，YANG Jiansong，WANG Lu，WANG Depei
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Aspergillus niger TN09,is a citric acid producing strain. In order to further improve the production of citric acid，citric acid production fungus Aspergillus niger TN09,was mutagenesised by plasma. The spore suspension after mutagenesis，which was cultured 72h at 35℃，was spread on the liquid medium of the liquefied corn. Then the diameter of the transparent circle was measured. It is considered as citric screening strains if the diameter of the transparent circle of the colony was greater than 2.2cm，the diameter of the colony was greater than 0.5cm，and the ratio was greater than 4.8,coloneis. A highyielding strain was obtained through shake flask rescreening. The new strain has genetic stability and the citric acid yield increased by 8.67% compared with that of the original strain(yield of citric acid 12.46g/dL).

Aspergillus niger；citric acid；plasma mutation；

TS201.3

A

1672-6510(2014)01-0016-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.01.004

2013–07–11；

2013–10–21

國家高技術研究發展計劃“863計劃”資助項目(2011AA02A205)

劉 燕（1987—），女，河南人，碩士研究生；通信作者：王德培，教授，wangdp@tust.edu.cn.