豬股骨頭膠原蛋白降血壓肽的分離純化

劉小紅，李 誠*，付 剛，蘇 趙

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

豬股骨頭膠原蛋白降血壓肽的分離純化

劉小紅，李 誠*，付 剛，蘇 趙

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

依次采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶對豬股骨頭膠原蛋白進行酶解，制備降血壓肽。為了得到高活性、高純度的降血壓肽，依次采用超濾、離子交換層析、凝膠層析對酶解液進行分離純化，采用體外檢測方法測定各分離產物對血管緊張素轉化酶活性的半抑制濃度（IC50值）。結果顯示：豬骨酶解液經超濾分離獲得分子質量小于5 ku的組分對血管緊張素轉化酶的抑制活性最高，IC50值為1.400 2 mg/mL；該組分進行離子交換層析分離得4個組分，其中組分2的活性最高，IC50值為0.488 4 mg/mL；再將組分2進行凝膠層析分離得4個組分，其中組分2-2的活性最高，IC50值為0.195 3 mg/mL。

酶解；降血壓肽；超濾；離子交換層析；凝膠層析；血管緊張素轉化酶半抑制濃度

我國是一個畜禽養殖大國，2010年我國肉類總產量達到7 925萬t，畜禽骨產量大約達到2 000萬t，但大量的骨頭都被廢棄了，其深加工率不足2%，這不僅造成了資源的巨大浪費，而且還會因骨頭所富含的營養物質易于腐敗而造成嚴重的環境污染[1-2]。作為養豬業發達的國家，如何科學、有效、高值化開展豬骨綜合利用就成為一個重要的問題，目前從食物原料中開發功能活性肽成為科學家們研究的熱點，其中降血壓活性肽是目前研究較多的一類，而食源性蛋白降血壓肽由于其無毒、無副作用、安全性高，可開發成降壓藥物或者降壓保健品[3]，這種通過保健食品的途徑預防和緩解高血壓癥狀的手段對人類來說具有非常重要的現實意義[4-5]，值得進行深入研究。

降血壓肽，又稱為血管緊張素轉化酶（angioensin-Ⅰconverting enzyme，ACE）抑制肽，是從食物蛋白中分離出的具有顯著降低血壓功效的多肽短鏈物質[6]，這些多肽的氨基酸序列和肽鏈長度各有不同，但都具有類似的功能。自Oshima等[7]從明膠蛋白中獲得ACE抑制肽起，學者們相繼從植物蛋白[8-11]、水產蛋白[12-15]、乳源蛋白[16-18]以及肉類蛋白[19-20]的酶解物中提取出降血壓肽。以骨為原料制備降血壓肽的研究報道雖然不少，但大多都只是酶解工藝的研究或以單一酶進行酶解以及單一的手段分離純化，如魏庭浩[21]采用胰蛋白酶酶解豬骨制備降血壓肽，并用超濾對酶解液進行了初步的分離；王金玲等[22]以酸性蛋白酶酶解帶魚脊骨并用超濾分離得到了分子質量在3 ku以下的降血壓肽，其半抑制濃度（half maximal (50%) inhibitory concentration，IC50）為0.727 mg/mL；王英超等[23]采用凝膠層析對羊骨降血壓肽進行了分離純化。本實驗分別采用了堿性、中性、酸性蛋白酶解豬骨，在最大程度上充分利用了原料，提高了降血壓肽的得率。在生物活性肽的研究中，分離純化是一個重要環節，只有達到一定的純度，肽的某種生物活性才能得以體現，故本實驗將酶解液依次通過超濾、離子交換層析、凝膠層析進行分離純化，以期獲得高活性且純度較高的降血壓肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬骨 雅安農貿市場；豬骨粉 實驗室自制；UNO-S陽離子交換樹脂 美國Bio-Rad公司；木瓜蛋白酶、風胃蛋白酶、堿性蛋白酶 帝斯曼中國有限公司；ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（hippuryl-His-Leu，HHL）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

蛋白層析儀 美國Bio-rad公司；超濾管（5、10 ku） 美國Millipore公司；QT-2漩渦混勻器 上海琪特分析儀器有限公司；UV-3200紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；ULT冷凍干燥機 美國Thermo Scientific公司；D37520 Osterode高速冷凍離心機 德國Biofuge公司；ULUP-IV-10T超純水裝置 西安優普儀器設備有限公司；PHS-3C型pH計 成都世紀方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離純化豬骨降血壓肽的工藝過程

制備酶解液→超濾→離子交換層析→凝膠層析

1.3.1.1 酶解液的制備

稱取一定量的豬骨粉，按底物含量為6%（m/m）加入相應體積的蒸餾水，再按酶活為12 000 U/g加入堿性蛋白酶，調節pH值為10.1，在58.1 ℃反應7 h后，100 ℃沸水浴10 min滅活；再調節pH值為6.1，按酶活為6 000 U/g加入木瓜蛋白酶，55 ℃反應4.38 h時后，100 ℃沸水浴10 min滅活；再調節pH值為7.0，按酶活為11 783 U/g加入風味蛋白酶，52.2 ℃反應4.43 h后，100 ℃沸水浴10 min滅活，冷卻后10 000 r/ min離心10 min，上清液即為后續實驗所需的酶解液。

1.3.1.2 超濾

首先將酶解液用截留分子質量為10 ku的超濾管進行超濾，然后將分子質量小于10 ku的酶解液用5 ku的超濾管進行超濾。得到分子質量范圍為＞10 ku、5～10 ku、＜5 ku 3個組分，分別測定其ACE抑制率，收集體外ACE抑制率最高的組分，測定其IC50值，凍干備用。

1.3.1.3 離子交換層析

采用蛋白層次儀對收集組分進行線性梯度洗脫。層析條件：UNO-S陽離子交換樹脂，洗脫液為含不同濃度NaCl的0.02 mol/L醋酸鈉。首先用超純水將蛋白層析儀的A、B泵沖開，用A液（0.02 mol/L醋酸鈉）平衡柱子，上樣，再用A液和B液（含不同濃度NaCl的0.02 mol/L醋酸鈉）進行線性梯度洗脫，洗脫程序：A液100%～0、B液0～100%，收集洗脫液，清洗交換劑、管道和裝置。測定每管洗脫液在214 nm波長處的吸光度，考察不同流速、離子強度、pH值對分離效果的影響，測定各組分ACE抑制率，收集體外ACE抑制率最高的組分，測定其IC50值。

1）流速對分離效果的影響：A液為0.02 mol/L醋酸鈉（pH 4.0），B液為含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L醋酸鈉（pH 4.0），考察不同流速（0.5、1.0、1.5 mL/min）對分離純化效果的影響，確定最適流速；2）離子濃度對分離效果的影響：A液為濃度為0.02 mol/L醋酸鈉（pH 4.0），B液為含不同濃度NaCl的0.02 mol/L醋酸鈉（pH 4.0），流速為1 mL/min，考察不同離子濃度（0.75、1.0、1.25 mol/L）對分離純化效果的影響，確定最適離子濃度；3）洗脫液pH值對分離效果的影響：A液為0.02 mol/L醋酸鈉，B液為含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L醋酸鈉，流速為1 mL/min，考察洗脫液的不同pH值（3.6、4.0、4.4）對分離純化效果的影響，確定最適pH值。

1.3.1.4 凝膠層析

經過超濾之后得到的降血壓肽分子質量大都小于5 ku，而Sephadex G-25的分離范圍在1～5 ku之間，故選用Sephadex G-25作進一步的分離，選用超純水作為洗脫液。首先用超純水平衡柱子，上樣，再用超純水洗脫，收集洗脫液，清洗交換劑、管道和裝置。測定每管洗脫液在214 nm波長處的吸光度，考察不同流速（0.3、0.5、1.0、1.5 mL/min）對分離純化效果的影響，確定最適流速。

1.3.2 降血壓肽活性的測定[24]

ACE能夠催化分解血管緊張素Ⅰ的模擬物HHL產生馬尿酸，該物質在228 nm波長處具有特征吸收峰，其含量與該特征吸收峰有一定相關性。當加入ACE抑制肽時，抑制肽與ACE活性區域作用，使ACE對HHL的催化分解作用受到抑制，馬尿酸的生成量減少。通過測定吸光度，判斷馬尿酸生成量，從而確定水解物的ACE抑制率。具體操作參考文獻[24]。

按下式計算ACE抑制率：

ACE抑制率/%=（Ab—Aa）/（Ab—Ac）×100

式中：Aa為樣品與ACE、HHL共同反應后的吸光度；Ab為ACE與HHL完全反應后的吸光度；Ac為ACE與HHL反應的空白對照的吸光度。

1.3.3 IC50值測定方法

將樣品配制成不同的質量濃度，分別測定其ACE抑制率，以樣品質量濃度為橫坐標、ACE抑制率為縱坐標，繪制圓滑曲線，計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 超濾對酶解液的分離效果

酶解液經超濾管初步分離，共得到3個組分，分別收集這3個組分進行ACE抑制率的測定，結果見圖1。分子質量小于5 ku的肽抑制率最高，IC50值為1.400 2 mg/mL，因此收集分子質量小于5 ku的肽作進一步的分離。

圖1 各組分的ACE抑制率Fig.1 ACE inhibitory activity of ultrafiltration fractions

2.2 離子交換層析對分子質量小于5 ku肽的分離效果

2.2.1 流速對分離效果的影響

圖2 不同流速的分離效果圖譜Fig.2 Separation efficiency at different flow rates

由圖2可知，流速對分離效果影響較大，當流速為0.5、1 mL/min時，分離效果相近，峰形相似，都得到4個峰，但當流速為1.5 mL/min時，只能得到3個峰，不能將峰3和峰4分開，因此為了縮短分離時間并保持較好的分離效果，采用流速為1 mL/min。

2.2.2 離子濃度對分離效果的影響

圖3 不同離子濃度的分離效果圖譜Fig.3 Separation efficiency at different ion concentrations

由圖3可知，離子濃度對分離效果影響并不大，這3個離子濃度條件下的分離效果相近，出峰的時間也相近，都得到4個峰，從峰形和成本2個方面綜合考慮，采用離子濃度為1 mol/L。

2.2.3 洗脫液pH值對分離效果的影響

圖4 不同pH值的分離效果圖譜Fig.4 Separation efficiency at different eluent pH values

由圖4可知，洗脫液的pH值對分離效果影響較大，當pH值為4.0時，可以得到4個峰形較好的峰；當pH值為3.6時，只能得到3個峰，與pH 4.0時的圖譜相比，峰1和峰2不能分開；當pH值為4.4時，只能得到2個峰，與pH 4.0時的圖譜相比，峰1和峰2、峰3和峰4均不能分開，因此洗脫液的pH值選用4.0。

2.2.4 洗脫條件的確定

圖5 最優條件下的離子交換分離圖譜Fig.5 Ion exchange chromatogram under the optimum separation conditions

綜合以上得出最佳洗脫條件：A液為0.02 mol/L醋酸鈉（pH 4.0），B液為含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L醋酸鈉（pH4.0），前40管用100%A液洗脫，后110管按100%～0%A液、0%～100%B液梯度洗脫，流速為1 mL/min，該條件下的分離圖譜見圖5。分別收集這4個組分進行ACE抑制率的測定，結果見圖6。4個組分之間的抑制率有明顯差異，在相同質量濃度下，組分2的抑制活性最高，IC50值為0.488 4 mg/mL，比超濾之后得到的降血壓肽活性提高了將近3倍，因此收集組分2進行進一步分離。

圖6 最優條件下分離所得的各組分的ACE抑制率Fig.6 ACE inhibitory rates of four peaks obtained by ion exchange chromatography under the optimum conditions

2.3 凝膠層析對組分2的分離效果

由圖7可知，流速對分離效果影響較大，當流速為1.5 mL/min時，僅能得到1個峰，并沒有將組分2分開；當流速為1 mL/min時，可以得到3個峰，但峰形不好，后2個峰分離度不高；當流速為0.5、0.3 mL/min時，分離效果相近，都得到4個峰，且峰形相差不大，為縮短分離時間并保持較高的分離效果，采用0.5 mL/min。分別收集這4個組分進行ACE抑制率的測定，結果見圖8。4個組分之間的抑制率有明顯差異，在相同質量濃度下組分2-2的抑制活性最高，且IC50為0.195 3 mg/mL，比離子交換層析得到的降血壓肽活性提高了2.5倍。

圖7 不同流速的分離效果圖譜Fig.7 Separation efficiency at different flow rates

圖8 各組分的ACE抑制率Fig.8 ACE inhibitory rates of four sub-peaks obtained by gel permeation chromatography

3 結 論

超濾對粗酶解液分離純化結果表明：分子質量小于5 ku的肽的ACE抑制率最高，且IC50為1.400 2 mg/mL，此時得到的IC50比魏庭浩[21]的研究結果高，可能由于該研究中主要測定的為分子質量小于3 ku的肽段，而據許多文獻報道，具有較高降血壓活性的肽段分子質量小于3 ku[25]。由于分子質量小于3 ku的肽段含量很低，如果采用3 ku的超濾管超濾會大大降低降血壓肽的得率，因此僅針對超濾之后小于5 ku的肽組分進行離子交換層析，其分離純化結果表明組分2的ACE抑制率最高，且IC50為0.488 4 mg/mL，比純化前的降血壓肽活性提高了將近3倍。凝膠層析對離子交換層析得到活性最高的肽組分的分離純化結果表明：組分2-2的ACE抑制率最高，且IC50為0.195 3 mg/mL，比離子交換層析得到的降血壓肽活性提高了2.5倍。

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Separation and Purification of Anti-hypertensive Peptides from Pig Femoral Collagen

LIU Xiao-hong, LI Cheng*, FU Gang, SU Zhao
(College of Food, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Anti-hypertensive peptides were prepared from pig femoral bones by sequential hydrolysis using alkaline protease, papain and fl avourzyme. In order to obtain high activity and purity of anti-hypertensive peptides, ultraf i ltration, ion exchange chromatography and gel permeation chromatography were used to separate the hydrolysates. The angioensin-Ⅰconverting enzyme (ACE) inhibitory activity (IC50) of the separated fractions was determined in vitro. The results showed that the ultraf i ltration fraction with molecular weight of less than 5 ku showed the highest ACE inhibitory activity, with an IC50value of 1.400 2 mg/mL. The fraction was then purif i ed by ion exchange chromatography to obtain 4 peaks, among which peak 2 had the strongest ACE inhibitory activity with an IC50value of 0.488 4 mg/mL. The peak 2 was further fractionated by gel permeation chromatography to obtain 4 sub-peaks, and the sub-peak 2-2 had the highest ACE-inhibitory activity with an IC50value of 0.195 3 mg/mL.

enzymatic hydrolysis; anti-hypertensive peptides; ultraf i ltration; ion exchange chromatography; gel permeation chromatography; half inhibitory concentration of angioensin-Ⅰ converting enzyme

S879.9

A

1002-6630（2014）06-0050-05

10.7506/spkx1002-6630-2014060010

2013-04-09

劉小紅（1985—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：252903387@qq.com

*通信作者：李誠（1964—），男，教授，博士，研究方向為畜產品加工與質量安全控制。E-mail：lichenglcp@163.com