北京、山東和湖南地區煙粉虱抗藥性及CYP4v2和CYP6CX1 mRNA水平表達量分析

楊 鑫， 謝 文， 王少麗， 吳青君， 徐寶云， 周小毛， 張友軍＊

（1．湖南農業大學農藥研究所，長沙 410128；2．中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

煙粉虱（Bemisia tabaci Gennadius）屬半翅目， 粉虱科，小粉虱屬，是危害極為廣泛的世界性害蟲之一。煙粉虱屬于刺吸式昆蟲，取食寄主植物的汁液，通過直接刺吸為害、傳播植物病毒、引起植物生理紊亂、分泌蜜露誘發真菌病害給作物生產造成巨大的經濟損失［1－2］。煙粉虱于1889年首先發現于希臘煙草上，分布于世界100多個國家，由于地理差異和寄主廣泛等原因逐漸形成多個復合種，目前報道的至少有32個隱種，不同隱種的煙粉虱在寄主范圍、傳毒能力、共生菌組成以及抗藥性等方面都存在顯著差異，在所有隱種中，B隱種和Q隱種煙粉虱入侵性最強，世界范圍內分布最為廣泛［3］。煙粉虱在我國最早報道于1949年［4］，暴發于20世紀90年代，當時B隱種煙粉虱主要存在于廣東、山東、河北、天津和北京等地，給農業、園藝及觀賞作物產業造成了嚴重的經濟損失［5－6］。2003年之前在我國發生為害的主要是B隱種煙粉虱，隨后在河北、北京等地田間發現Q隱種煙粉虱，并且在2007年發現Q隱種煙粉虱逐漸取代B隱種煙粉虱成為主要為害種群［7－9］。

在害蟲的防治措施中，化學防治占居重要地位，為延緩和阻止眾多嚴重為害經濟作物的害蟲暴發做出了重要貢獻。但是由于常年、廣泛使用殺蟲劑，導致很多地區害蟲對一些種類的殺蟲劑產生不同程度的抗藥性，并且在全國監測發現Q隱種煙粉虱對于一些殺蟲劑的抗性要高于B隱種煙粉虱，連年施用后抗藥性也逐漸增強［10－12］，所以連續的、適時的抗藥性監測是煙粉虱綜合防治的前提和基礎。

煙粉虱的抗藥性產生機制是多方面的。現在關于煙粉虱的抗藥性研究主要集中在解毒酶上，Karunker和Roditakis研究發現細胞色素解毒酶P450家族的基因在B隱種和Q隱種煙粉虱的吡蟲啉抗性中發揮重要的作用［13－15］。Xie［16］等通過 B隱種煙粉虱噻蟲嗪抗性和敏感品系的轉錄組研究，發現CYP4v2基因在抗性品系中過量表達，同時Zhuang［17］等發現CYP6CX1的過量表達在煙粉虱對吡蟲啉抗性中也產生一定貢獻。

本研究對北京、山東和湖南三地的煙粉虱B、Q隱種類型進行了鑒定，同時測定了其對5種常用殺蟲劑的抗藥性，并且通過熒光定量PCR檢測了CYP4v2和CYP6CX1基因在3個不同地區田間種群的mRNA水平表達情況，從而為解釋田間抗藥性形成機制和指導當地煙粉虱的化學防治提供科學依據。

1 材料與方法

1．1 煙粉虱試蟲

2011年秋季，分別從北京海淀區中國農業科學院蔬菜花卉所實驗基地（BJHD，39°57′N，116°19′E），山東濟陽茄子田（SDJY，39°49′N，117°04′E）和湖南長沙農科院黃瓜大棚（CSHN，28°12′N，113°05′E）采集煙粉虱成蟲。敏感種群為中國農業科學院蔬菜花卉研究所室內飼養種群（T H－S），該種群于2000年采自試驗基地的甘藍寄主上，實驗室以甘藍飼養至今，從未接觸過任何殺蟲藥劑。田間采集的煙粉虱分別取300頭活體成蟲（分裝于3個離心管，每管100頭），液氮速凍5 min，然后保存于－80℃冰箱用于熒光定量PCR檢測。

1．2 供試殺蟲劑

25%噻蟲嗪水分散粒劑（瑞士先正達作物保護有限公司產品）、1．8%阿維菌素乳油（北京中農大生物技術股份有限公司產品）、10%聯苯菊酯乳油（蘇州富美實植物保護劑有限公司產品）和48%毒死蜱乳油（美國陶氏益農公司產品）。

1．3 主要試劑

昆蟲基因組DNA提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒均購自北京百泰克生物技術有限公司；Taq酶，c DNA合成試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit）購自北京六合通經貿有限公司（Ta KaRa Biotech）；TRIzol，熒光定量試劑盒（SYBR?Green Real－ti me PCR Master Mix）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1．4 B、Q隱種鑒定

煙粉虱成蟲B、Q隱種鑒定參照潘慧鵬［9］的方法進行。檢測每個種群選取10頭，單頭提取DNA，依據B和Q隱種煙粉虱mt COI基因序列片段長度差異使用特異性引物進行鑒別（見表2），其中Q隱種煙粉虱的特異性片段為478 bp，而B隱種煙粉虱為303 bp。

1．5 抗藥性監測

煙粉虱成蟲對殺蟲劑的生物測定方法采用浸葉法，具體操作參照Feng［18］。每種供試藥劑配制6個濃度及1組空白對照，每個濃度4次重復，藥劑配制加入0．1‰曲拉通X－100。在指形管底部鋪上2%的瓊脂約2 mL（管壁無水汽），將預先用打孔器打好的甘藍葉片浸藥10 s，晾干后背面朝上輕放于瓊脂上。每管接入20～30頭煙粉虱，用棉塞封口。指形管倒置于（25±1）℃，L∥D＝14 h∥10 h的光照培養箱內，48 h后檢查各處理的死亡數和存活數。

1．6 RNA提取和c DNA合成

每個樣品取煙粉虱100頭，采用TRIzol法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，以及Nanodr op2000檢測RNA濃度。取1．0μg RNA利用Pri meScript?RT reagent Kit合成c DNA ，方法按照產品說明書進行 （除去了基因組DNA）。

1．7 熒光定量PCR

熒光定量PCR引物參照Zhuang［17］進行（見表1），具體操作參照天根的熒光定量試劑盒說明書，稀釋2倍的反轉錄產物作為模板，利用ABI7500進行基因mRNA水平表達量分析。熒光定量PCR反應體 系：SYBR Green Real－ti me PCR Master Mix（2×）11．25μL，PCR For war d Pri mer（10μmol／L）0．5μL，PCR Reverse Pri mer（10μmol／L）0．5μL，c DNA模板1．0μL，加入dd H2O 補足到25μL。Real－Ti me PCR反應程序為：95℃預變性3 min，接下來是40個循環，95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸40 s（收集熒光信號）；每個樣品3次重復，PCR反應結束后進行相關數據分析。

表1 本研究中應用的引物1）Table 1 Pri mers used in this study

1．8 數據處理

生測結果分析采用Probit軟件進行，計算各種群對不同殺蟲劑的LC50值及其95%的置信區間、斜率及標準誤。抗性倍數＝所測種群的LC50／敏感種群的LC50。抗性分級標準參照劉鳳沂等［19］，抗性倍數小于3倍為敏感水平，3．1～5．0倍屬于敏感性降低，5．1～10倍為低水平抗性，10．1～40倍為中等水平抗性，40．1～160倍為高水平抗性，160倍以上為極高水平抗性。

目的基因表達量以內參基因（Actin）作為標準進行相對定量，Actin基因在不同發育階段和齡期的煙粉虱體內mRNA水平表達量穩定，可以作為內參基因。基因表達量分析以敏感種群T H－S作為對照種群，采用2－△△Ct方法計算：相對表達量＝2－△△Ct＝2－（［E－F］－［A－B］）。 其 中 A 為 對 照 種 群基因的Ct值；B為對照種群內參基因Ct值；E為待測田間種群基因的Ct值，F為待測田間種群內參基因Ct值，Ct值取3次重復相差不超過0．5Ct值的平均值。

2 結果與分析

2．1 隱種鑒定

從北京、山東和湖南煙粉虱樣品中隨機選取10頭，提取基因組DNA后分別用B和Q鑒定引物進行PCR擴增，得到的片段長度約為478 bp，說明北京、山東和湖南地區供試煙粉虱均為Q隱種（見圖1）。

2．2 抗藥性監測

本研究中各樣品采用成蟲浸葉法進行抗藥性生測，結果見表2。從表中可以看出，山東地區煙粉虱種群對阿維菌素的抗性水平比較高（14．2倍），達到中抗水平，北京地區和湖南地區種群對其都處于敏感狀態。對于煙堿類殺蟲劑噻蟲嗪，三地種群都有不同程度的抗藥性，其中長沙地區種群對噻蟲嗪抗性水平最高，達到49．08倍，屬于高抗水平。山東濟陽和北京海淀對噻蟲嗪的抗性水平相當，都處于中抗水平。由于所用的敏感種群對于毒死蜱不敏感，所以監測的3個田間種群毒死蜱的抗性水平都很低。湖南地區種群對聯苯菊酯屬于低抗水平（9．64倍），山東和北京地區的煙粉虱對聯苯菊酯的抗性都 屬于敏感水平。

圖1 北京海淀、山東濟陽和湖南長沙地區煙粉虱隱種鑒定Fig．1 Identification of B．tabaci sibling species in Haidian of Beijing，Jiyang of Shandong and Changsha of Hunan

表2 北京、山東和湖南地區煙粉虱對4種殺蟲劑的抗藥性Table 2 Resistance to four insecticides of B．tabaci from Beijing，Shandong and Hunan

2．3 熒光定量

以室內敏感種群T H－S煙粉虱為對照種群，通過熒光定量PCR分析了BJHD、SDJY和HNCS種群中CYP4v2和CYP6CX1基因的相對表達量（圖2），相對于敏感種群發現CYP4v2基因在3個田間種群表達量顯著提高，分別達到3．85倍，19．57倍和10．78倍，而CYP6CX1基因只是在BJHD種群中過量表達20．55倍，結果表明這兩個P450基因在煙粉虱對藥劑的田間抗性中可能起到重要作用。

3 討論

1949年，我國首次發現煙粉虱，由于種群密度很低未形成危害［4］。直到20世紀90年代，世界超級害蟲B隱種煙粉虱入侵我國，由于其很高的繁殖能力迅速在我國蔓延并造成嚴重的危害。而從2003年開始陸續在全國發現Q隱種煙粉虱，并且從2007年至今逐漸取代B隱種煙粉虱成為主要蔬菜花卉害蟲。由于煙粉虱能夠傳播眾多植物病毒，如煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒導致很多番茄種植大棚減產甚至絕產，造成嚴重的經濟損失［7－9］，所以明確各地產生危害的煙粉虱隱種對于有效防治具有重要作用。

Q煙粉虱比B煙粉虱具有更強的抗藥性，在田間復雜的環境中能對多種殺蟲劑產生很高的抗藥性，如 Wang［11］2008年在江蘇地區發現具有1 900倍吡蟲啉抗性和1 200倍噻蟲嗪抗性的YC－Q種群，其他研究者也通過實驗室篩選和田間采集獲得具有很高抗藥性的煙粉虱種群，表明煙粉虱具有產生很高抗藥性的潛力［20－21］。

圖2 田間煙粉虱的CYP4v2和CYP6CX1基因表達量Fig．2 Expression profiles of CYP4v2 and CYP6CX1 in B．tabaci from field samples

筆者采集北京、山東和湖南三地的煙粉虱樣品，對4種常用殺蟲劑進行了毒力測定。結果表明總體上北京地區煙粉虱對于大部分藥劑的抗性水平要低于山東和湖南地區，其中對阿維菌素和聯苯菊酯的抗藥性都處于敏感水平，表明在北京地區施用這兩類殺蟲劑具有很好的防效。而對于傳統藥劑毒死蜱雖然抗性仍處于敏感水平，但是三地包括敏感種群的LC50值都相對比較高，表明該藥劑對于防治煙粉虱效果不佳，同時該地區煙粉虱對于煙堿類藥劑噻蟲嗪的抗性程度也不高。在2008年，Luo［10］和王少麗［20］監測后發現噻蟲嗪、吡蟲啉抗性處于抵抗水平（LC50分別為6．45和4．11 mg／L），而2010年抗性達到中抗水平，2011年未發生顯著上升，可能與該地區的施藥習慣有關。山東濟陽噻蟲嗪LC50達到150．09 mg／L，抗性水平也達到7．84倍，屬于低抗水平。同時對于田間防效較好的阿維菌素抗性水平達到14．2倍，原因可能是該類殺蟲劑在山東地區大量施用后產生了較強的選擇壓力，所以促使了抗性的產生，該地區煙粉虱對其他藥劑的抗性水平都較低。湖南長沙2010年煙粉虱為B隱種，2011年采集的煙粉虱為Q隱種，抗性水平也顯著升高，其中以噻蟲嗪最為明顯，LC50由222．26 mg／L上升到938．46 mg／L，抗性倍數也顯著升高，表明田間Q隱種煙粉虱比B隱種煙粉虱具有更高的殺蟲劑適應機制，對某些藥劑易形成抗藥性，所以在該地區進行煙粉虱防治的過程中要選用有利于控制Q隱種煙粉虱的藥劑。

田間害蟲抗藥性形成機制主要有兩類，其一是殺蟲劑作用靶標的改變，導致藥劑的結合能力降低，從而產生較高的抗藥性，如Liu［22］發現褐飛虱乙酰膽堿受體突變（Y151）形成了很高的吡蟲啉抗性。而另一種產生抗藥性的機制是害蟲體內的解毒代謝作用引起的。解毒酶在昆蟲抗藥性產生過程中具有重要的作用，常見的解毒酶有多功能氧化酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽轉移酶等，其中細胞色素多功能氧化酶P450在多種昆蟲中報道與抗性相關［23］。在煙粉虱體內，P450與抗藥性的形成也有重要的關系，如Karunker報道的煙粉虱吡蟲啉抗性與CYP6CM1基因過量表達有關，并且通過體外降解試驗發現該酶能夠代謝吡蟲啉［13－14］。Xie等通過對B隱種煙粉虱噻蟲嗪抗性和敏感品系的轉錄組研究，發現CYP4v2基因在抗性品系中過量表達可能與煙粉虱對噻蟲嗪抗性有關［16］；Zhuang等也發現田間抗藥性的產生可能與CYP6CX1基因的過量表達有關［17］；本研究也分析了北京、山東和湖南地區煙粉虱CYP4v2和CYP6CX1基因mRNA水平的表達量，發現相對于敏感種群CYP4v2基因在3個田間種群表達量顯著提高，分別達到3．85倍，19．57倍和10．78倍，而CYP6CX1基因只是在BJHD種群中過量表達20．55倍，結果表明這兩個P450基因的過量表達可能與北京、山東以及湖南地區的煙粉虱對噻蟲嗪相對較高的抗藥性有關，同時也有可能與其他藥劑如毒死蜱、聯苯菊酯較高的LC50有關，需要通過進一步的體外表達降解試驗研究，來確定抗性機制。

由于田間環境的多樣性以及野外煙粉虱遺傳背景的復雜性，研究田間抗藥性產生的機制是一個漫長而艱難的過程，需要通過進一步的研究分析來闡述煙粉虱抗藥性的形成原因，為延緩和阻止煙粉虱的為害奠定理論基礎，從而更好地進行防治工作。

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