內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑的研制

李舒雯， 周金偉， 易有金＊， 柏連陽， 曹 熙

（1．湖南農業大學食品科技學院，長沙 410128；2．湖南農業大學生物安全學院，長沙 410128）

我國每年使用大量的化學農藥制劑，容易造成農藥殘留超標，生物富集，不僅污染生態環境，還影響人類的健康［1－2］。生物農藥副作用小、對人無害，是一種具有廣闊前景的綠色農藥［3］，日益成為全球農藥發展的一種趨勢［4］。

近年來研究表明，植物內生細菌對許多植物病原生物具有良好的抑制作用［5－8］，內生細菌的研究已成為植物病害生物防治的一個研究熱點。本研究從煙草植物組織中分離得到一株內生抗菌細菌011，經鑒定其為短短芽胞桿菌［Brevibacillus brevis（Migula）Shida et al．］，Gen Bank登錄號為 DQ444285［9］。011菌不僅對煙草青枯病具有良好的防治效果［9］，而且其發酵濾液還對8種植物病原真菌都有抑制作用，其中對番茄早疫病菌菌絲及孢子均有致畸作用，對番茄早疫病菌最低抑菌濃度MIC為30%，有效抑菌中濃度EC50為9．64%［10］，具有很大的生防開發潛力。

目前常規化學殺菌劑防效低，污染環境，而開發活體微生物可濕性粉劑在現代農藥制劑中有廣泛的適用范圍［11－14］。本研究旨在研制短短芽胞桿菌011可濕性粉劑，確定其制劑成分，為開發高效低毒活體微生物殺菌制劑提供基礎，符合現代社會對農業生產及有害生物綜合防治（IPM）的要求。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

內生短短芽胞桿菌011菌株（Brevibacillus brevis）由湖南省食品科學與生物技術重點實驗室分離、鑒定與保存。供試辣椒疫病菌（Phytophthor a capsici Leonian）由湖南農業大學植物病理實驗室提供。

1．1．2 培養基

BPY液體培養基、PDA固體培養基［15］。

1．1．3 供試試劑

載體：膨潤土、滑石粉、高嶺土、硅藻土、白炭黑。

助劑：十二烷基苯磺酸鈉（DBS）、聚乙二醇（PEG8000）、吐溫－60、木質素磺酸鈉、木質素磺酸鈣、羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）。

保護劑：抗壞血酸（VC）、糊精、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）。

穩定劑：碳酸鈣、磷酸氫二鉀、羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）。

1．2 方法

1．2．1 內生短短芽胞桿菌011發酵制備

種子液制備：用接種環挑取斜面保存的011菌株，接入BPY液體培養基中，裝液量100 mL／250 mL，初始p H6．8，30℃，搖床180 r／min振蕩培養24 h。

發酵培養：將以1%（V／V）接種量接入裝液量100 mL／250 mL發酵培養液中，30℃振蕩培養60 h，搖床轉速為180 r／min。芽胞含量≥4．0×1011，芽胞率≥90%。

1．2．2 檢測方法

采用平板菌落計數法，測定制劑的芽胞含量。

按照《中華人民共和國國家標準》對內生菌短短芽胞桿菌011可濕性粉劑進行測定。潤濕時間測定參照GB／T 5451－2001，懸浮率測定參照 GB／T 14825－2006，細度測定參照 GB／T 16150－1995，p H 測定參照 GB／T 1601－1993，加速貯存試驗按GB／T 19136－2003。

1．2．3 制劑加工工藝

將內生短短芽胞桿菌011搖瓶發酵液與載體按一定比例混合制成母液，鼓風干燥60℃烘干，研磨制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散劑、濕潤劑、穩定劑等，經噴霧干燥進風溫度175℃，出風溫度60℃制成可濕性粉劑。

1．2．4 初始制劑成分配比

發酵液70%，載體10%，助劑10%，穩定劑2%，保護劑0．1%，白炭黑補足至100%。

1．2．5 載體的篩選

菌株發酵為液態，選擇膨潤土、滑石粉、高嶺土、硅藻土、白炭黑不同材料做載體，檢測均勻母粉的濕潤性、重量懸浮率，用平板菌落計數法測定各制劑的芽胞含量，比較各載體制劑松散性、成本等方面因素，選擇最優載體。

1．2．6 助劑篩選及復配助劑配比確定

在所制成的母粉中，分別添加10%的助劑，噴霧干燥加工成制劑，測定各制劑的潤濕時間，時間越短其潤濕性越好；比較各制劑懸浮率的差異，懸浮率越高，分散性越好；測定芽胞含量，根據結果篩選出最佳潤濕劑、分散劑。

從助劑中篩選出懸浮性較高，潤濕性較好的助劑。按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的質量比經粉碎機混合均勻，噴霧干燥制成可濕性粉劑，測定其懸浮率、潤濕時間，選擇出復配助劑的最佳質量配比。

1．2．7 穩定劑的篩選

將篩選出的填料、發酵液、濕潤劑及分散劑分別與待選穩定劑（2%）混合均勻后噴霧干燥加工成可濕性粉劑，以不加穩定劑的為對照。加速貯藏穩定性：進行熱貯（54±2）℃，14 d后測定芽胞存活率。每個處理重復3次。

1．2．8 保護劑的篩選

將篩選出的填料、發酵液、濕潤劑及分散劑分別與待選保護劑（0．1%）加工成可濕性粉劑，以不加保護劑為對照，稀釋后涂布在平板上，每個處理重復3次，在距離254 n m紫外燈（20 W）40 c m處照射12、24 h后，計算芽胞存活率。

1．2．9 制劑穩定性測定

取100 g內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑置于（4±2）℃和室溫（25℃）條件下貯存，每10 d測定樣品的芽胞含量，測定11次，確定制劑貯存期間芽胞含量的變化。

2 結果與分析

2．1 載體的篩選

載體在可濕性粉劑中占較大比例，因此載體的潤濕性和懸浮率對制劑的潤濕性和懸浮率影響大。由表1可知：各制劑的潤濕時間均達到國家標準。各載體親水性較強且表面積大，導致吸水性強。其中滑石粉制劑的濕潤時間為10 s。不同材質的載體顆粒不同，故懸浮率有差異。膨潤土、硅藻土制劑懸浮率分別為60%、68%，均低于標準，高嶺土、滑石粉、白炭黑所制成的制劑懸浮率≥70%，具有較好的懸浮率，適用于本研究制劑的開發。將制備的各制劑于室溫（25℃）貯藏14 d后測定活芽胞含量。綜合考慮各制劑懸浮率、潤濕時間、價格等因素，篩選出最適載體。其中滑石粉制劑，芽胞含量貯存后有2．16×109cf u／g，高于其他載體制劑。

表1 載體對制劑理化性質的影響Table 1 Effects of filler on wettable powder

2．2 助劑篩選

將待選助劑（10%）與已選定的載體、發酵液混合均勻后噴霧干燥加工成可濕性粉劑，測定潤濕時間、懸浮率及芽胞含量，篩選出最佳助劑。由表2可知：雖吐溫－60潤濕時間短，但懸浮率僅為44%；而以CMC－Na為分散劑時，制劑的懸浮率高，但其潤濕時間長達293 s。而以木質素磺酸鈣為分散劑，其懸浮率高，可達74%，十二烷基苯磺酸鈉作為潤濕劑，其潤濕時間最短，為4 s。因此，選擇木質素磺酸鈣與十二烷基苯磺酸鈉復配，篩選出最佳復配比例。

表2 助劑對制劑理化性質的影響Table 2 Effects of additives on wettable powder

由表3可知：分散劑的含量逐步增加時，其懸浮率升高；而潤濕時間來看，隨著潤濕劑的減少，其潤濕時間逐漸增長。當比例為7∶3時，011菌可濕性粉劑懸浮率為81%，潤濕時間17 s達到標準，兼顧成本故確定木質素磺酸鈣－十二烷基苯磺酸質量比為7∶3。

2．2．1 穩定劑的篩選

穩定劑能在較長時間內穩定制劑的理化性質，還能提高制劑的滲透性，保證制劑在一定時期內芽胞含量穩定。試驗結果見表4：在3種穩定劑中，羧甲基纖維素鈉作為穩定劑，熱貯后芽胞存活率高達54%，而對照芽胞存活率僅為37%。

表4 穩定劑對制劑熱貯的影響Table 4 Effects of stabilizer on wettable powder

表5 保護劑對制劑的影響Table 5 Effects of UV protective agenton wettable powder

2．2．2 保護劑的篩選

UV保護劑能將陽光中的大部分紫外輻射吸收掉，將吸收的能量轉化為無害的熱能散發到空氣中，從而保護制劑達到所需要的效果。由表5可知：選用糊精為011菌可濕性粉劑UV保護劑時，紫外照射12、24 h，芽胞存活率均高出VC和SDS，分別達64%、42%，故選糊精為UV保護劑。

2．3 011菌可濕性粉劑穩定性測定

內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑在25℃室溫、（4±2）℃下貯存100 d芽胞含量變化見圖1。由圖1可知，內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑在室溫25℃下貯藏芽胞存活率明顯低于（4±2）℃溫度。011菌在（4±2）℃貯藏100 d，其芽胞存活率可達90%，而在室溫貯藏100 d其芽胞存活率僅為72%。因芽胞桿菌在低溫處于休眠狀態，易于保存。

圖1 011菌可濕性粉劑貯藏期芽胞存活率變化Fig．1 Change of spore survival rate in strain 011 wettable powder during storage

2．4 制劑指標

根據對內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑填料、助劑等篩選試驗，確定了內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑最佳配方：滑石粉10%，木質素磺酸鈣7%，DBS3%，CMC－Na2%，糊精0．1%。按照中華人民共和國農藥相關國家標準進行測定，結果顯示制備的內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑在25℃室溫下芽胞含量為1．8×1010cfu／g，p H6．8，懸浮率76%，潤濕時間52 s，細度通過率98%，制劑貯藏100 d存活率達72%。

3 討論

生防菌的芽胞存活力是決定其最終防效的因素之一［16］，選擇適合的載體和助劑時，含芽胞數量成為衡量可濕性粉劑最佳配方的首要因素。因暫無短短芽胞桿菌可濕性粉劑國家標準，參照2013年實施的《中華人民共和國農藥行業標準NY／Y2293．2－2012》，枯草芽胞桿菌可濕性粉劑含胞量指標≥1．0×1010cf u／g，研制的短短芽胞桿菌011可濕性粉劑芽胞含量為1．8×1010cf u／g，符合參照枯草芽胞桿菌可濕性粉劑含胞量行業標準。

載體在可濕性粉劑中占有較大比例，因此載體的潤濕性和懸浮率對制劑的潤濕性和懸浮率有主要影響。本研究表明芽胞在滑石粉載體中含量穩定，吸附量大，故選取滑石粉為制劑載體。李慧［17］等研究表明，滑石粉可以降低外界不良因素對活菌體的損害，還能使菌體吸附于載體上，具有一定的緩釋效果，在貯藏期內菌體釋放率較高，菌劑中活菌數保持在1010～1011數量級，同時通過電鏡觀察，片層狀的滑石粉為細菌菌株提供了豐富的吸附位點。Jayaraman［18］等將滑石粉用作微生物農藥的主要添加劑。助劑不僅可以提高防效，延長貨架期，還能降低成本［19］。篩選的羧甲基纖維素鈉是一種黏附劑，此類高分子物質，具有黏附作用和使藥液黏稠，故有利于芽胞生存，抵抗惡劣環境，又因羧甲基纖維素鈉具有吸濕性及分散性，還能提高011菌可濕性粉劑濕潤性及分散性，故選羧甲基纖維素鈉為穩定劑。

開發活體微生物殺菌劑不僅提高了農作物的經濟效益，又能保護生態環境。本研究短短芽胞桿菌011對多種植物病原菌具有很好的抑菌效果，制備的內生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑，迄今文獻中未見研究報道。為下一步開發短短芽胞桿菌可濕性粉劑的配方篩選奠定了基礎。

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