十二烷基苯磺酸鈉降解菌篩選與其降解特性研究

溫 鋼，叢學(xué)琦

(吉林化工學(xué)院生物工程技術(shù)系，吉林吉林132022)

十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl benzene sulfonate.簡(jiǎn)稱SDBS)作為一種陰離子表面活性劑，被廣泛用于合成人工洗滌劑，是人工洗滌劑主要有效成分［1］.隨著人工洗滌劑使用范圍的擴(kuò)大和使用量的增加，使SDBS可通過(guò)多種渠道進(jìn)入環(huán)境中，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染.目前，學(xué)者們對(duì)SDBS的致畸性和致癌性的觀點(diǎn)不一，但是可以肯定的是，SDBS攝取過(guò)量對(duì)生物來(lái)說(shuō)有一定毒性［2-4］.生物降解法能夠完全降解環(huán)境中的SDBS，因此利用微生物來(lái)處理含SDBS污水是目前較實(shí)用的一種方法［5］.本研究以SDBS作為唯一碳源，通過(guò)對(duì)松花江龍?zhí)稑蚺盼劭谖勰噙M(jìn)行篩選和分離，得到了兩株能以SDBS為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株MB3和MB4菌株，并對(duì)其降解特性進(jìn)行研究.

1 材料和方法

1.1 菌種來(lái)源

吉林市龍?zhí)稑蛳律钗鬯盼劭?/p>

1.2 培養(yǎng)基［6］

(1)富集培養(yǎng)基

MgSO4·7H2O 0.14 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.000 5 g，K2HPO40.33 g，KCl 0.06 g，酵母膏 1.2 g，SDBS 0.025 g，pH 7.0.

(2)篩選培養(yǎng)基

MgSO4·7H2O 0.14 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.000 5 g，K2HPO40.33 g，KCl 0.06 g，酵母膏 1.2 g，SDBS 0.05 g，瓊脂 15 g，pH 7.0.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基

MgSO4·7H2O 0.14 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.000 5 g，K2HPO40.33 g，KCl 0.06 g，酵母膏1.2 g，SDBS 濃度視情況而定，pH 7.0.

1.3 方法

(1)菌種的富集

1 g污泥加入10 mL無(wú)菌水中，搖勻，制成10%的菌懸液.用移液槍吸取1 mL菌懸液加入99 mL富集培養(yǎng)基中，30℃、140 r/min搖床培養(yǎng)3 d.

(2)菌株的篩選

用稀釋法對(duì)富集后的菌液依次進(jìn)行稀釋，將濃度為10－6、10－7、10－8的稀釋液分別涂布于篩選培養(yǎng)平板上，30℃培養(yǎng)5 d后，挑取生長(zhǎng)旺盛的單菌落于篩選培養(yǎng)平板中反復(fù)劃線，對(duì)菌株進(jìn)行純化，然后接種于斜面保存.

(3)菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定

菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，SDBS的濃度為100 mg/L，30℃、140 r/min搖床培養(yǎng)，用分光光度計(jì)測(cè)定460 nm處的OD值［7］.

(4)SDBS降解率測(cè)定

采用亞甲藍(lán)分光光度法［8］.

(5)菌株SDBS最高耐受濃度的確定

將菌懸液加入SDBS濃度分別為700、800、900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400 mg/L 的富集培養(yǎng)基的試管中，并設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照.陰性對(duì)照為只含有富集培養(yǎng)基的試管，陽(yáng)性對(duì)照為只加入菌懸液和富集培養(yǎng)基、不加SDBS的試管.30℃培養(yǎng)24 h后觀察各個(gè)試管中是否有菌膜產(chǎn)生.

(6)最佳降解條件的確定

設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)［9］，考慮酵母膏濃度、接種量、SDBS濃度、培養(yǎng)時(shí)間四種因素.由于本試驗(yàn)為四因素三水平試驗(yàn)，故可選用L9(34)正交表.并采用極差分析法分析數(shù)據(jù).

(7)混合菌株降解率的測(cè)定

將得到的MB3和MB4兩種菌株按照41，3 1，2 2，1 3，1 4 的比例接種，裝液量 50 mL/250 mL錐形瓶，接種量 4%，30℃，140 r/min，培養(yǎng)36 h，測(cè)定各組SDBS降解率.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及其降解率的測(cè)定

經(jīng)過(guò)對(duì)樣品的富集培養(yǎng)后，通過(guò)初篩、復(fù)篩，得到4種菌.用亞甲藍(lán)分光度計(jì)法測(cè)定其SDBS降解率，選取兩株降解率分別為70.80%和71.67%的菌株為目的菌株，分別命名為MB3菌株和MB4菌株.MB3菌株菌落呈土黃色、不透明、邊緣整齊，表面濕潤(rùn);MB4菌株呈白色、透明、邊緣整齊，表面濕潤(rùn).

2.2 MB3菌株和MB4菌株的鑒定試驗(yàn)

MB3和MB4的鑒定按文獻(xiàn)［10］進(jìn)行.鑒定結(jié)果如表1.初步鑒定MB3菌株屬于黃桿菌屬(Flavobacterium sp.);MB4菌株屬于瓊斯氏菌屬(Jonesia sp.).

表1 MB3和MB4菌株鑒定結(jié)果

2.3 MB3和MB4菌株生長(zhǎng)及其降解特性

(1)MB3、MB4菌株微生物量隨時(shí)間的變化

MB3菌株的生長(zhǎng)曲線如圖1，在前6 h內(nèi)菌株的微生物量變化很小，此時(shí)菌體處于遲緩期;在6～10 h內(nèi)菌株的微生物量迅速增加，菌株在此時(shí)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;在第10～22 h內(nèi)的微生物量開(kāi)始穩(wěn)定，開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期.MB4菌株在剛接種的前4h內(nèi)，微生物量變化不大，處于遲緩期;在培養(yǎng)時(shí)間為4～10 h內(nèi)，菌種的微生物量迅速增加，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;在10～32 h內(nèi)，菌種的微生物量基本不變，處于穩(wěn)定期;在32 h后菌種的微生物量開(kāi)始下降，開(kāi)始進(jìn)入衰退期.如圖2.

圖1 MB3微生物量隨時(shí)間變化的曲線

圖2 MB4菌株微生物量隨時(shí)間變化的曲線

(2)MB3、MB4菌株SDBS降解率隨時(shí)間的變化

MB3菌株在培養(yǎng)12 h內(nèi)SDBS的降解速率最快，在12～48 h內(nèi)降SDBS的解速率變小，在48 h降解率達(dá)到最大，并保持穩(wěn)定，如圖3所示.MB4菌株在培養(yǎng)12 h內(nèi)SDBS的降解速率最快，在12～36 h內(nèi)降SDBS的解速率變小，在48 h降解率達(dá)到最大，并保持穩(wěn)定，如圖4所示.

圖3 MB3 SDBS降解率隨時(shí)間變化的曲線

圖4 MB4 SDBS降解率隨時(shí)間變化的曲線

(3)MB3和MB4菌株SDBS降解率隨底物濃度的變化

將MB3和MB4菌株分別接入SDBS濃度為100、200、300、400、500、600 mg/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%，在30℃條件下，140 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)量SDBS的降解率.結(jié)果如圖5.

圖5 降解率隨SDBS濃度變化的曲線

從中可看出，兩種菌株在SDBS濃度為400 mg/L以下時(shí)，隨著SDBS濃度的增加，SDBS降解能力逐漸增加;在400 mg/L時(shí)，SDBS的降解率最高.在高于400 mg/L后，兩種菌株的降解率開(kāi)始隨著SDBS濃度的增加而降低.

(4)MB3和MB4菌株SDBS降解率隨接種量的變化

用接種環(huán)分別挑取MB3、MB4菌株，按接種量為2%、4%、6%、8%、10%，接種到 50 mL，SDBS濃度為100 mg/L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，140 r/min下培養(yǎng)48 h，測(cè)其SDBS降解率.結(jié)果如圖6.MB3菌株的降解率在接種量為4%時(shí)最高，而MB4菌株在接種量為6%時(shí)降解率最高.在低接種量時(shí)，由于菌種的數(shù)量有限，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需時(shí)間更長(zhǎng)，SDBS的濃度遠(yuǎn)超過(guò)菌株利用量，使得SDBS降解率偏小.而在高接種量時(shí)，菌種會(huì)更快的達(dá)到穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生的廢物累積的速率更快，使得菌種過(guò)早的進(jìn)入衰亡期，造成SDBS的降解率同樣不高.

圖6 降解率隨接種量變化的變化曲線

(5)MB3和MB4菌株SDBS降解率隨酵母膏濃度的變化

分別取1 mL MB3和MB4菌液(OD460為0.6)接種到酵母膏濃度(g/L)分別為 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 的富集培養(yǎng)基中.裝液量 50 mL/250 mL錐形瓶，SDBS濃度100 mg/L，在30℃，140 r/min下，培養(yǎng)48 h后，測(cè)定SDBS的降解率.結(jié)果如圖7所示.從圖中可以看出，菌株MB3菌株在酵母膏濃度為1.6 g/L時(shí)SDBS降解率最高，MB4菌株在酵母膏濃度為1.2 g/L時(shí)SDBS降解率最高.

圖7 降解率隨酵母膏濃度變化的變化曲線

(6)MB3和MB4菌株SDBS最高耐受力

MB3菌株的 SDBS耐受力為900 mg/L，而MB4菌株的SDBS耐受力高達(dá)1 300 mg/L.但是在實(shí)驗(yàn)中，明顯發(fā)現(xiàn)，MB3菌株產(chǎn)生的菌膜厚度要比同濃度下MB4菌株產(chǎn)生的菌膜要厚.這說(shuō)明相同條件下，MB3菌株的生長(zhǎng)情況要比MB4菌株的生長(zhǎng)情況要好.

(7)MB3和MB4菌株正交試驗(yàn)確定最佳降解條件

MB4菌株正交試驗(yàn)方案與數(shù)據(jù)分析表如表2(MB3略)，影響MB3菌株降解能力的因素由主到次分別為SDBS濃度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、酵母膏濃度.降解的最佳條件為:酵母膏濃度為2.0 g/L、接種量為6%、SDBS濃度為400 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為36 h.影響MB4菌株降解能力的因素由主到次分別為培養(yǎng)時(shí)間、接種量、酵母膏濃度、SDBS濃度.降解的最佳條件為:酵母膏濃度為1.6 g/L、接種量為4%、SDBS濃度為400 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為36 h.

(8)混合菌株降解能力的測(cè)定

用接種環(huán)挑取一環(huán)MB3、MB4菌株，分別接入到20 mL無(wú)菌水中，制成菌懸液.然后按MB4和 MB3 菌株比例為4 1，3 1，2 2，1 3，1 4 接種兩種菌株到含50 mL SDBS濃度為400 mg/L的富集培養(yǎng)基中，接種量為4%，在30℃，140 r/mmin下培養(yǎng)36 h.測(cè)定降解率.結(jié)果如表3.從表中可以看出，混合菌的降解能力比單一菌株的降解能力好，最高降解率可以達(dá)到85%.

表3 混合菌的降解率

3 結(jié) 論

從吉林市龍?zhí)稑蛏钗鬯盼劭诓杉勰啵?jīng)富集培養(yǎng)和初篩復(fù)篩后分離得到兩株SDBS降解率較高的菌株MB3和MB4.當(dāng)培養(yǎng)基中SDBS濃度為100 mg/L時(shí)，在30℃、140 r/min條件下培養(yǎng)3 d，MB3菌株和MB4菌株SDBS的降解率分別為70.80%和71.67%.根據(jù)MB3和MB4菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征等，初步鑒定其分別屬于黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)、瓊斯氏菌屬(Jonesia sp.).

MB3和MB4兩種菌株的SDBS最高耐受力分別為900 mg/L和1 300 mg/L.

30℃、裝液量為50 mL菌液/250 mL三角燒瓶、搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min條件下，通過(guò)正交試驗(yàn)，最終確定MB3菌株在酵母膏濃度為2.0 g/L、接種量為6%、SDBS濃度為400 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為36 h時(shí)，降解率最高，達(dá)到70.35%.MB4菌株在酵母膏濃度為1.6 g/L、接種量為4%、SDBS濃度為400 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為36 h時(shí)降解率最高，達(dá)到 76.36%.

將MB3和MB4菌株按一定比例混合，結(jié)果顯示，混合菌SDBS的降解率比單一菌株的SDBS降解率高，且最高可達(dá)85%.

［1］ 吳楚.十二烷基苯磺酸鈉降解菌的分離鑒定與特性研究［J］.上海建設(shè)科技，2007(01):57-59.

［2］ 余坦健，簡(jiǎn)紀(jì)長(zhǎng)，林興，等.十二烷基苯磺酸鈉對(duì)奧尼羅非魚(yú)免疫毒性的研究［J］.南方水產(chǎn)，2008，06(4):33-37.

［3］ 劉雷，陳蓮花，劉浩，等.十二烷基苯磺酸鈉對(duì)銅綠微囊藻光合作用的影響［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2008，38(5):289-292.

［4］ 韓俊娟，任春娥，韓海燕，等.十二烷基苯磺酸鈉對(duì)雄性小鼠生育能力的影響［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜質(zhì)，2012，28(8):1836-1842.

［5］ 張學(xué)佳，紀(jì)巍，康志軍，等.烷基苯磺酸鈉(LAS)在環(huán)境水體中自然降解［J］.黑龍江水專學(xué)報(bào)，2008，38(2):77-79.

［6］ 應(yīng)啟鋒，肖昌松，紀(jì)樹(shù)蘭，等.直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)的生物降解性［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2002，29(5):13-17.

［7］ 宋國(guó)明，張輝，余平.LAS降解菌分離、馴化及降解能力的研究［J］.巢湖學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6(3):93-98.

［8］ 汪海波，姚國(guó)峰.亞甲藍(lán)分光光度法測(cè)定陰離子表面活性劑的改進(jìn)［J］.安徽化工，2011(05):76-77.

［9］ 劉瑞江，張業(yè)旺，聞崇煒，等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法研究［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010(09):52-55.

［10］東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］北京:科學(xué)出版社，2001.