氨氯地平對糖尿病大鼠心肌梗死后骨髓內皮祖細胞動員及血管新生的改善作用*

董莉，孫佳音，康麗娜，羅倩，孫峰，顧明霞，印小榮，徐標

基礎與實驗研究

氨氯地平對糖尿病大鼠心肌梗死后骨髓內皮祖細胞動員及血管新生的改善作用*

董莉，孫佳音，康麗娜，羅倩，孫峰，顧明霞，印小榮，徐標

目的：觀察氨氯地平對糖尿病大鼠心肌梗死（心梗）后骨髓內皮祖細胞(EPC)動員和血管新生障礙的改善作用以及對心功能的影響，并探討其可能的分子機制。

糖尿病；心肌梗死；內皮祖細胞；血管新生；氨氯地平

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:718.)

糖尿病患者易患心肌梗死（心梗）、缺血性腦卒中、下肢動脈閉塞等血管并發癥，而且發生缺血事件后預后較差，在很大程度與糖尿病血管內皮修復能力降低以及血管新生障礙有關[1]。研究顯示，缺血組織的血管新生及側支形成不僅依賴于原位血管的芽生與重塑，骨髓起源的內皮祖細胞（EPC）也在缺血后反應性的血管新生中發揮重要作用[2]。然而糖尿病患者與糖尿病大鼠血循環中EPC數量減少并且存在功能缺陷[3,4]。糖尿病伴心肌缺血時，血管新生及側支循環形成減少，導致心梗面積擴大，心功能減退[5]。新近有研究報道，氨氯地平可以減輕冠心病患者心肌缺血后再灌注損傷[6]，具體機制目前尚不明了。本研究利用大鼠急性心梗模型，觀察氨氯地平是否可以改善糖尿病大鼠心肌缺血誘導的血管新生以及心梗后心功能，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

糖尿病模型的建立：2012-04至2012-12選取180～200 g SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠（南京大學模式動物研究所）60只，隨機分為糖尿病大鼠（n=40）， 給予高脂飼料（上海斯萊克實驗動物有限公司）飼養四周后，腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）一次，第3 d后測血糖、血脂及血漿胰島素水平，并計算胰島素敏感指數。空腹血糖＞10 mmol/L或餐后血糖＞16.7 mmol/L即為糖尿病模型建立成功,此后繼續高脂飼料喂養四周；非糖尿病大鼠（n=20） 為正常飲食飼養。

心肌梗死模型的建立和分組：參見文獻[7，8]，建立大鼠心梗模型，具體方法如下：40只糖尿病大鼠麻醉后，氣管插管，呼吸機輔助通氣。左胸開口，結扎冠狀動脈（冠脈）左前降支，超聲心動圖及肉眼觀察證實心梗模型建立成功。術后將糖尿病大鼠隨機分成對照組（n=20），每日予以0.5%羧甲基纖維素鈉溶劑1 ml灌胃，繼續高脂喂養四周；治療組（n=20）每日予以氨氯地平2 mg/kg（美國輝瑞公司）灌胃。

外周血早期內皮祖細胞檢測：參照文獻[9]，定義外周血中骨髓起源的早期EPCs 為不表達或弱表達造血細胞表面標記CD45，同時表達原始的造血—血管干細胞表面標記CD133和內皮細胞特異性表面標記血管內皮生長因子受體-2（VEGFR-2）/激酶插入受體（KDR）的細胞群。于術前及術后不同時間點（第1、3、5、7、14、28 d）采血，采用Histopaque-10831（天津灝洋生物制品科技有限公司）,密度梯度離心法獲取大鼠外周血單個核細胞。依次加入異硫氰酸熒光素標記的小鼠抗大鼠CD45（美國Invitrogen公司），兔抗大鼠CD133（英國Abcam公司）和生物素標記的小鼠抗大鼠血管內皮生長因子（VEGFR-2/ KDR，美國Novus Biologicals公司），3種大鼠早期EPC單克隆抗體，4℃避光孵育20 min，紅細胞裂解液（美國Biolegend公司）避光孵育10 min后，采用FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD公司）檢測，用Cell Quest軟件（美國BIO-RAD公司）分析外周血單個核細胞中CD45-/low+/CD133+/KDR+早期EPC比例。

血漿血管內皮生長因子水平測定：于術前及術后不同時間點（第1、3、5、7、14、28 d）采血，酶聯免疫吸附法測定血漿中VEGF水平, 操作按照檢測試劑盒（英國Abcam公司）說明書進行。

心功能檢測：40只糖尿病大鼠給藥治療四周后，應用彩色多普勒超聲診斷儀（探頭頻率10 MHz，美國GE公司）檢測糖尿病大鼠心梗后心功能。糖尿病大鼠麻醉后，將探頭放置在胸骨左緣3～4肋間，指向左上方顯示左心室長軸斷面，測量左心室舒張末期內徑和左心室收縮末期內徑，舒張末期及收縮末期室間隔厚度，舒張末期及收縮末期左心室后壁厚度，左心室短軸縮短率和左心室射血分數等參數。

心肌梗死周圍區毛細血管密度測定：應用CD31染色法檢測治療四周后心梗周圍區組織微血管密度。心臟超聲檢查后處死大鼠，取出心臟制成5 μm冰凍切片。冰凍切片用4%多聚甲醛固定15 min后，加入小鼠抗大鼠CD31多克隆抗體（1:200，美國BD公司），4 ℃過夜孵育。充分洗滌后加入熒光二抗，常溫孵育2 h，4 '，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.5 mg/ml，美國Sigma-Aldrich公司）染核后采用熒光顯微鏡計數心梗周圍區毛細血管密度。心臟內新生血管內皮細胞與CD31抗體結合，呈現紅色熒光（Alexa Fluor 594），DAPI非特異性與細胞核結合呈現藍色熒光。

蛋白質印跡法檢測骨髓細胞信號分子蛋白表達水平：糖尿病心梗大鼠給藥治療一周后處死，以外科手法暴露大鼠股骨及脛腓骨，用大量磷酸鹽緩沖液 （0.01 mmol/L，PH 7.2～7.4）反復沖洗骨髓，將沖洗液用200目紗網過濾后離心，獲取骨髓細胞。用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液提取細胞膜總蛋白，凝膠電泳，濕性電轉法轉膜。轉移蛋白膜條以5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別與小鼠抗大鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt，1:2 000）及其相應磷酸化產物（p-Akt，1:2 000），內皮型一氧化氮合酶（eNOS，1:1000）及其相應磷酸化產物（p-eNOS，1:500，美國BD公司），兔抗大鼠基質金屬蛋白酶-9（MMP-9，英國Abcam公司），兔抗大鼠β-肌動蛋白（β-actin，1:2000，美國Santa Cruz公司）等多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫孵育2 h。免疫反應結束后以增強的化學發光法顯影、洗片，用Quantity One圖象分析軟件（美國BIO-RAD公司）分析，將待測蛋白條帶與同一泳道β-actin條帶光密度比值作為結果，并以p-Akt/Akt和 p-eNOS/ eNOS光密度比值作為相應蛋白活化水平。

統計學分析：應用SPASS17. 0 軟件進行統計學分析，計量數據用均數±標準差表示，組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

60只大鼠基本生理情況：與非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠飼養五周后體重增長顯著[（435.4±36.1）g 比 （376.9±23.1） g]，差異有統計學意義（P＜0.05）。糖尿病大鼠給予小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射一周后，其空腹血糖、餐后血糖、總膽固醇、甘油三酯及空腹胰島素水平均顯著高于非糖尿病大鼠，胰島素敏感指數下降，差異均有統計學意義（P＜0.01）。表1

表1 糖尿病與非糖尿病大鼠不同飼養方式飼養五周后基本生理情況

表1 糖尿病與非糖尿病大鼠不同飼養方式飼養五周后基本生理情況

注：與非糖尿病大鼠相比*P＜0.05 **P＜0.01。 △：注射小劑量鏈脲菌素1 周后，體重除外

非糖尿病大鼠 (n=20) 糖尿病大鼠△(n=40)體重 (g) 376.9±23.1 435.4±36.1*空腹血糖 (mmol/L) 4.15±0.53 16.12±2.69**餐后血糖 (mmol/L) 10.16±1.27 29.66±3.23**總膽固醇 (mmol/L) 1.54±0.28 2.27±0.82**甘油三酯 (mmol/L) 0.76±0.18 2.43±1.54**空腹胰島素 (mIU/L) 35.31±4.22 72.42±9.64**胰島素敏感指數 - 4.94±0.73 -7.63±0.77**

對照組和治療組不同時間點外周血內皮祖細胞水平的變化：對照組外周血CD45-/low+/CD133+/ KDR+EPC水平術后第5 d出現峰值（55±10/106單核細胞），治療組第7 d 出現峰值（112±30/106單核細胞），且較對照組升高，隨后兩組CD45-/low+/ CD133+/KDR+EPC水平均迅速下降；治療組糖尿病大鼠外周血CD45-/low+/CD133+/KDR+EPC水平術后第3 、5、7 d和第14 d較對照組同時間點均增高，差異均有統計學意義（P＜0.05～0.01）。圖1A

圖1 糖尿病大鼠心肌梗死前后不同時間點外周血內皮祖細胞及血管內皮生長因子水平變化（n=20 ）

對照組和治療組不同時間點血管內皮生長因子水平的變化：對照組糖尿病大鼠血漿VEGF水平在心梗后第5d達到峰值[（3.68±0.98） ng/L]，治療組在第7d達到峰值[（5.63±1.33）ng/L]，且較對照組升高，隨后兩組均逐漸下降。治療組糖尿病大鼠血漿VEGF水平在心梗后第5、7 d較對照組同時間點均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05～0.01）。圖1B

蛋白質印跡檢測兩組用藥后骨髓細胞信號分子蛋白表達水平的變化：兩組糖尿病心梗大鼠給藥7 d 后，治療組骨髓中EPC動員相關信號分子Akt、eNOS的活化水平較對照組均顯著增加[p-Akt/ Akt:（1.80±0.15） 比（1.10±0.15）；p-eNOS/eNOS:（0.92±0.12）比（0.53±0.10）；MMP-9的蛋白表達水平：（1.08±0.0.06）比（0.68±0.090）] ，較對照組顯著增加，差異均有統計學意義P＜0.01。圖2

圖2 兩組糖尿病心肌梗死大鼠治療一周后骨髓中蛋白激酶B、內皮型一氧化氮合酶以及基質金屬蛋白酶-9蛋白表達的免疫印跡圖。（n=20）

CD31染色法檢測治療四周后兩組糖尿病大鼠心梗周圍區組織微血管密度的改變：治療組心梗周圍區毛細血管密度較對照組顯著增加[（72.36±5.02）比（58.06±4.27）]，差異有統計學意義（P＜0.05）。 圖3

圖3 CD31染色法檢測治療四周后兩組糖尿病大鼠心梗周圍區組織微血管密度的改變

兩組糖尿病大鼠心梗后心功能的比較： 與對照組比較，治療組糖尿病大鼠心梗四周后左心室收縮末期內徑減小，收縮末期室間隔厚度明顯增加，左心室射血分數和短軸縮短率均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05～0.01）。表2

表2 兩組糖尿病心梗大鼠治療四周后心臟結構及功能超聲指標

表2 兩組糖尿病心梗大鼠治療四周后心臟結構及功能超聲指標

注：與對照組相比*P＜0.05 **P＜0.01

超聲指標 對照組 (n=20) 治療組 (n=20)左心室舒張末期內徑 (mm) 7.58±0.64 7.08±0.78左心室收縮末期內徑 (mm) 5.66±0.51 5.04±0.36*舒張期末室間隔厚度 (mm) 1.04±0.26 1.36±0.12收縮期末室間隔厚度 (mm) 1.36±0.29 1.89±0.21*舒張期末左心室后壁厚度 (mm) 1.90±0.28 2.18±0.22收縮期末左心室后壁厚度 (mm) 2.64±0.73 2.96±0.42左心室射血分數 (%) 49.3 ±3.8 66.2 ±2.6**左心室短軸縮短率 (%) 21.2 ±2.6 35.1 ±2.4**

3討論

本研究采用高脂飼料聯合小劑量鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠實驗模型。高脂飲食飼養后，大鼠體重明顯增加，繼之以小劑量鏈脲佐菌素損傷胰島功能，大鼠呈現空腹及餐后血糖升高，伴血漿胰島素水平升高，而胰島素敏感指數下降，能夠模擬臨床上伴有胰島素抵抗的2型糖尿病狀態。另外，高脂飼養大鼠呈現血漿總膽固醇及甘油三酯水平升高，結扎冠脈左前降支建立急性心梗模型，能夠模擬臨床上冠脈粥樣硬化性心臟病伴急性心肌缺血狀況。在本研究中，我們證實了氨氯地平可以改善糖尿病大鼠缺血誘導的骨髓來源EPC動員障礙，這種作用伴隨EPC動員相關的VEGF/Akt/eNOS/ MMP-9 信號通路活化增強。此外，氨氯地平治療促進心梗周圍區組織血管新生，改善糖尿病大鼠心梗后心功能。

循環中的EPC主要來源于骨髓。組織缺血缺氧發生后，損傷部位生成增加的缺氧誘導因子1α刺激VEGF的表達與釋放[10]。在骨髓組織中，VEGF與骨髓細胞表面受體結合后激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/eNOS途徑，導致NO的合成與釋放增加[11]。NO促進骨髓中MMP-9表達增加、活性增強，后者促進EPC在骨髓內募集并向外周血遷移[12]。動員至外周血的EPC特異性地歸巢到缺血組織，通過分化增殖、遷移整合等機制參與新生血管的形成，改善缺血組織的血循環[13]。然而糖尿病時增強的氧化應激和高血糖本身可阻礙上述信號通路級聯激活，導致組織缺血損傷后EPC動員以及血管新生障礙[14]。有研究報導，氨氯地平可通過阻斷eNOS與質膜小窩蛋白的抑制性結合，促進VEGF誘導的NO釋放，從而改善血管內皮功能[15]。本實驗中，我們觀察到糖尿病心梗大鼠服用氨氯地平治療7d后，循環中EPC水平顯著升高、伴隨VEGF釋放增加，同時骨髓中p-Akt、p-eNOS及MMP-9的表達亦明顯升高，推測氨氯地平通過改善VEGF/Akt /eNOS/MMP-9信號通路的活化，促進骨髓中EPC釋放至外周血，進而參與缺血組織的血管新生。

冠脈閉塞發生后，代償性的側支血管生成決定了心肌缺血及心功能受損的嚴重程度。而冠心病患者循環中EPCs數量及功能下降與血管內皮依賴性舒張功能障礙相關。氨氯地平以前被證實有利于減輕小鼠心肌梗死后的左心室重構并改善心梗后心功能[16]。本研究發現糖尿病心肌梗死大鼠應用氨氯地平治療四周后，心梗周圍區毛細血管密度明顯增加；同時，作為反映左心室收縮功能的指標，左心室射血分數及左心室短軸縮短率較對照組有顯著改善，提示氨氯地平治療促進糖尿病大鼠心肌缺血后代償性血管新生，從而改善左心室收縮功能。此外，治療組大鼠心梗后左心室收縮末期內徑較對照組明顯降低，伴收縮期末室間隔厚度增加，表明氨氯地平亦可減輕糖尿病大鼠心梗后失代償性心室擴張，抑制心肌重構，最終改善心功能。因此氨氯地平促進缺血區血管新生及側支形成可以起到自動恢復血運重建的作用，從而影響冠心病的病情程度及預后，這對合并有急性心梗的糖尿病患者來說是很有潛力的治療方式。

[1] Kolluru GK, Bir SC, Kevil CG. Endothelial dysfunction and diabetes: effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. Int J Vasc Med, 2012, 2012：918267.

[2] Thal MA, Krishnamurthy P, Mackie AR, et al. Enhanced angiogenic and cardiomyocyte differentiation capacity of epigenetically reprogrammed mouse and human endothelial progenitor cells augments their efficacy for ischemic myocardial repair. Circ Res, 2012, 111: 180-190.

[3] Fadini GP, Miorin M, Facco M, et al. Circulating endothelial progenitor cells are reduced in peripheral vascular complications of type 2 diabetes mellitus. J Am Coll Cardiol, 2005, 45: 1449-1457.

[4] 董莉, 徐標, 康麗娜, 等. 胰島素改善糖尿病小鼠骨髓內皮祖細胞動員障礙研究. 中國循環雜志, 2011, 26: 145-148.

[5] Lamblin N, Fertin M, de Groote P, et al. Cardiac remodeling and heart failure after a first anterior myocardial infarction in patients with diabetes mellitus. J Cardiovasc Med, 2012, 13: 353-359.

[6] Khan NA, Chattopadhyay P, Abid M, et al. Protective effects of amlodipine on mitochondrial injury in ischemic reperfused rat heart. Environ. Biol, 2012, 33: 591-595.

[7] Zhang J, Ding L, Zhao Y, et al. Collagen-targeting vascular endothelial growth factor improves cardiac performance after myocardial infarction. Circulation, 2009, 119: 1776-1784.

[8] 黃繼漢, 黃曉暉, 陳志揚, 等. 藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算. 中國臨床藥理學與治療學, 2004, 9: 1069-1072.

[9] Khakoo AY, Finkel T. Endothelial progenitor cells. Annu Rev Med, 2005, 56: 79-101.

[10] Poynter JA, Manukyan MC, Wang Y, et al. Systemic pretreatment with dimethyloxalylglycine increases myocardial HIF-1α and VEGF production and improves functional recovery after acute ischemia/ reperfusion. Surgery, 2011, 150: 278-283.

[11] Aicher A, Heeschen C, Mildner-Rihm C, et al. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nature Medicine, 2003, 9: 1370- 1376.

[12] Liu ZJ, Velazquez OC. Hyperoxia, endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxid Redox Signal, 2008, 10: 1869-1882.

[13] Jeon O, Song SJ, Bhang SH, et al. Additive effect of endothelial progenitor cell mobilization and bone marrow mononuclear cell transplantation on angiogenesis in mouse ischemic limbs. J Biomed Sci, 2007, 14: 323-330.

[14] Krankel N, Adams V, Linke A, et al. Hyperglycemia reduces survival and impairs function of circulating blood-derived progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005, 25: 698-703.

[15] Sharma A, Trane A, Yu C, et al. Amlodipine increases endothelial nitric oxide release by modulating binding of native eNOS protein complex to caveolin-1. Eur J Pharmacol, 2011, 659: 206-212.

[16] Ogino A, Takemura G, Kanamori H, et al. Amlodipine inhibits granulation tissue cell apoptosis through reducing calcineurin activity to attenuate postinfarction cardiac remodeling. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 293: H2271-2280.

Amlodipine Improves Endothelial Progenitor Cell Mobilization and Neo-vascularization in Experimental Diabetic Rats After Myocardial Infarction

DONG Li, SUN Jia-yin, KANG Li-na, LUO Qian, SUN Feng, GU Ming-xia, YIN Xiao-rong, XU Biao.
Department of Cardiology, Hospital of Nanjing Municipal Authorities, Nanjing (210018), Jiangsu, China

DONG Li, Email: dongli_nju@163.com

Objective: To observe the effect of amlodipine on bone marrow endothelial progenitor cell (EPC) mobilization, neo-vascularization and cardiac function in diabetic rats after myocardial infarction (MI) with the possible mechanisms.Methods: A total of 60 male SD rats were divided into 2 groups. Normal group, n=20. Diabetic group, n=40, the rats were fed with high fat diet (HFD) for 4 weeks and then received streptozotocin followed by left anterior descending coronary artery ligation to establish MI model, those rats were further divided into 2 sub-groups: Control group, the rats received sodium carboxymethylcellulose 1 ml/day with HFD and Treatment group, the rats received amlodipine 2 mg/kg/day with HFD, n=20 in each sub-group, all animals were treated for 4 weeks. The EPC level in peripheral blood CD45-/low+/CD133+/KDR+at before and 1, 3, 5, 7, 14, 28 days after operation were examined by fl ow cytometry, plasma vascular endothelial growth factor (VEGF) level was measured by ELISA, capillary density in MI area was determined by CD31 staining, EPC related protein expressions were detected by western blot analysis and the cardiacfunction was evaluated by echocardiography.Results: EPC in CD45-/low+/CD133+/KDR+in Treatment group at 7 days after operation was increased than Control group at 5 days after operation (112 ± 30/106) vs (55 ± 10/106), plasma VEGF in Treatment group was higher than Control group (5.63 ± 1.33) ng/L vs (3.68 ± 0.98) ng/L; Treatment group presented increased expressions of protein kinase B, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and matrix metallopeptidase-9, increased capillary density in MI area, higher LVEF and left ventricular fractional shorting, all P＜0.05-0.01.Conclusion: Amlodipine improves EPC mobilization, neo-vascularization and cardiac function in diabetic-MI rats, it may be related to VEGF/eNOS cascade activation.

Diabetes; Myocardial infarction; Endothelial progenitor cell; Neovascularization; Amlodipine

2013-10-23)

（助理編輯：曹洪紅）

南京市科技發展計劃項目(2011ZD016)

210018 江蘇省，南京市市級機關醫院 心內科（董莉、羅倩、孫峰、顧明霞、印小榮）；南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 心內科（孫佳音、康麗娜、徐標）

董莉 副主任醫師 博士 主要從事心血管疾病發病機制的研究 Email:dongli_nju@163.com 通訊作者：董莉

R541

A

1000-3614（2014）09-0718-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.09.016

方法：180～200g SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠60只隨機分為兩部分：糖尿病大鼠（n=40） 給予高脂飼料飼養四周后，腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素；非糖尿病大鼠(n=20) 為正常飲食飼養。40只糖尿病大鼠結扎冠狀動脈左前降支造成急性心梗模型。術后將大鼠隨機分成對照組(n=20)，每日予以0.5%羧甲基纖維素鈉溶劑1ml灌胃，治療組(n=20)每日予以氨氯地平2 mg/kg灌胃，繼續高脂喂養四周。流式細胞術檢測術前及術后不同時間點（第1、3、5、7、14和28 d）外周血CD45-/low+/CD133+/KDR+早期EPC數量，酶聯免疫吸附法檢測血漿血管內皮生長因子(VEGF)水平。CD31免疫熒光染色法評估心梗周圍區血管新生情況。超聲心動圖評估心功能。免疫印跡法測定骨髓細胞中EPC動員相關信號通路蛋白的表達。

結果：外周血CD45-/low+/CD133+/KDR+EPC水平術后峰值治療組（第7 d，112±30/106單核細胞）較對照組（第5 d，55±10/106單核細胞）升高；血漿VEGF水平在心梗后峰值治療組[第7 d ，（5.63±1.33）ng/L]較對照組[第5 d，(3.68±0.98) ng/L]升高；骨髓細胞蛋白激酶B與內皮型一氧化氮合酶的活化水平及基質金屬蛋白酶-9的表達增加；心梗周圍區新生毛細血管密度治療組大鼠較對照組顯著增加，左心室射血分數及左心室短軸縮短率明顯提高。上述比較差異均有統計學意義（P＜0.05～0.01）。

結論：氨氯地平治療改善糖尿病大鼠缺血誘導的骨髓EPC動員障礙，缺血區血管新生以及心梗后心功能。這種作用可能通過改善VEGF/內皮型一氧化氮合酶信號通路活化而介導。