應用微電極芯片技術評價抗心房顫動藥物對兔右心房快速起搏模型的影響*

孫娟 ，黃焰，張玲，馬嵋，郭新貴，焦昌安，郭玉君，劉海利，李天奇，徐文莉，馬依彤

應用微電極芯片技術評價抗心房顫動藥物對兔右心房快速起搏模型的影響*

孫娟 ，黃焰，張玲，馬嵋，郭新貴，焦昌安，郭玉君，劉海利，李天奇，徐文莉，馬依彤

目的：應用微電極芯片技術篩選和評價抗心房顫動（房顫）藥物對兔右心房快速起搏模型的影響。

心房快速起搏；微電極芯片；場電位時程；胺碘酮

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:639.)

心房顫動（房顫）是臨床上最常見的一種快速性心律失常[1]，其發病率隨人群年齡的增長而增加。ATRIA研究報道房顫患病率為 0.4%～1%[2]。胡大一等[3，4]的流行病學研究結果顯示：中國房顫的患病率為0.77%。其發病率和病死率隨著年齡的增長而顯著增長。由于房顫發生的確切分子基礎和電生理機制仍不清楚，建立與臨床具有相似病理生理特點的動物模型，是認識和治療房顫的有效措施。同時藥物篩選模型是發現新藥的重要條件，新模型的建立將會帶動新型藥物的出現。盡管藥物篩選模型的研究主要集中在分子細胞水平和轉基因動物模型方面，組織水平的篩選模型可以反映生理條件下的抗房顫藥物作用，觀察藥物對病理條件下心臟組織的作用。本文應用微創技術建立快速起搏兔右心房致房顫模型，結合微電極芯片技術，建立組織水平篩選和評價抗房顫藥物模型。

1 材料和方法

實驗動物及分組：2009-01至2009-06 選擇新西蘭大白兔32只，體重2.5～3 kg，雌雄不拘，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，動物質量屬于一級標準[許可證號：SCXK（新）2003-01]。隨機分為4組， 鉀離子通道阻斷劑Tetraethylammonium組（TEA組，n=8）：取24小時快速心房起搏（RAP）后的右心耳切片組織，置入到微電極芯片記錄盤中，用改良臺式液恒速灌流心臟標本，選擇刺激電極施加電壓2V，脈寬0.5 ms的脈沖連續刺激30 min。用含有20 mmol/L TEA的改良臺式液表面灌流以阻斷延遲整流型鉀通道（ IK ）。鉀離子通道阻斷劑氯化鋇組（BaCl2組，n=8）：用含有1×10-4mol/L BaCl2的改良臺式液灌流心臟標本10 min以阻斷內向整流鉀通道（Kir）。鉀離子通道阻斷劑氯化鎘組（CdCl2組，n=8）： 用含有1 mmol/L CdCl2的改良臺式液表面灌流標本10 min后以阻斷L-型鈣電流（ICa，L ）。胺碘酮組（n=8）：用含有2×10-6mmol/L 胺碘酮的改良臺式液恒速灌流標本10 min。

主要試劑、溶液成分和儀器：改良臺式液成分（mmol/L）: NaCl 144.0; KCl 5.0; CaCl21.8; MgCl21.0; NaH2PO40.33; Glucose 10.0; HEPES 5.0; pH 7.4。TEA（批號：045K0175）， 胺碘酮 （批號：126K1585）均為美國Sigma公司產品，其余試劑均為國產分析純。微電極芯片（德國），Stimulus Generator刺激儀（德國）。

快速心房起搏致房顫模型建立：用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經兔耳緣靜脈注射麻醉后，靜脈推注肝素1000 U抗凝。將兔仰位固定于兔臺上，頸部正中切口，分離右側頸內靜脈并切開，近頭端結扎，近心端置入一根6 F兩極電極（電極間距5 mm），在B超指引下定位，B超縱切引導，保持B超和電極平行，縱切觀察電極尖端位置是否正確；再以B超橫切引導，觀察到電極尖端在右心房內。應用LEAD-2000電生理儀（四川錦江電子科技）記錄心內電圖，以心內電生理圖出現高大A波小V波為理想記錄圖，固定電極導管。以600 次/分的固定頻率進行快速心房起搏24小時，脈寬 0.5 ms，強度 4V。起搏誘發房顫判斷標準：心臟電刺激時，記錄體表Ⅱ導聯心電圖，誘發房顫后同步記錄左、右心房電圖。持續時間＞ 5min的房顫為持續性房顫。當實驗動物生命體征不平穩，如出現心率緩慢、呼吸頻率不穩定時結束實驗。 快速起搏致房顫動物模型制作過程中，3只新西蘭大白兔死于電極尖端穿透心房游離壁心臟破裂，2只因呼吸衰竭死亡，補充同體重量的5只大白兔。其余實驗動物均在實驗時間完成實驗檢查。制作模型成功率75%，房顫持續時間5～10 s，給予冷鹽水敷于心臟可終止房顫的持續。

心房組織標本制備：新西蘭大白兔快速心房起搏24小時后，迅速開胸取心臟剪下右心耳切片，組織厚度500 μm，用銀絲圈將標本固定在微電極芯片記錄系統，改良臺式液恒速（3 ml/min）灌流心房組織30 min，溫度保持在37℃。Stimulus Generator刺激儀發出刺激強度在閾上二倍，波寬0.5 ms，頻率1 HZ的脈沖做驅動刺激，設置27號和36號電極分別為刺激電極的正負極。標本穩定30 min后開始記錄鉀通道阻斷劑和抗心律失常藥物對心房場電位時程的影響。

微電極芯片記錄場電位時程：微電極芯片是以8×8陣列的形式鑲嵌入60個氮化鈦電極，電極尖端直徑10 μm，相鄰電極間隔100μm。植于芯片底部的微電極記錄心臟組織切片電活動得到的原始信號，經放大器MEA1060（增益1200倍）調制后，由模數轉換卡MC-card數字化，使用軟件MCRack處理心肌組織場電位各項參數：第一個正向峰值（ FPpre）、第一個最大負向峰值（ FPmin）、最后正向最大峰值（ FPmax）以及場電位時程（ FPdur，從FPmin到FPmax的時間）。

統計學分析：所有數據均采用SPSS 16.0軟件處理，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用給藥前、后配對樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

TEA和BaCl2對快速心房起搏兔右心耳場電位時程的影響： TEA組用TEA改良臺式液灌流心房組織10 min后，右心耳場電位時程由（176.67±8.66）ms延長到（196.11±10.76）ms，場電位時程延長了10.55 ms，差異有統計學意義（P=0.012）。BaCl2組用BaCl2改良臺式液灌流后兔右心耳場電位時程由（182.22±12.87）ms延長到（191.11±13.09）ms，場電位時程延長了8.89 ms，差異有統計學意義（P=0.039）。圖1

圖1 給予TEA和BaCl2前后兔右心耳場電位時程變化

CdCl2對快速心房起搏兔右心耳場電位時程的影響：CdCl2組給與CdCl2改良臺式液灌流后兔右心耳場電位時程由（178.33±7.85）ms延長到（206.67±9.70）ms，差異有統計學意義（P=0.0015）。圖2

圖2 給予CdCl2前后兔右心耳場電位時程變化

胺碘酮對快速心房起搏兔右心耳場電位時程的影響：胺碘酮組用胺碘酮改良臺式液灌流后兔右心耳場電位時程由（167.38±13.67）ms延長到（185±15.14）ms，場電位時程延長了17.62 ms，差異有統計學意義（P=0.002）。圖3

圖3 給予胺碘酮前后兔右心耳場電位時程變化

3 討論

心肌細胞在藥物作用下，可對心肌細胞的細胞膜上蛋白、受體、細胞內的線粒體、微管等產生作用，這些變化可以綜合地體現在細胞的電生理功能的變化上。微電極陣列（MEA）能檢測各種離子通道在興奮水平時的離子運動、細胞間的信號傳遞等。由于檢測時，細胞和電極緊密藕合，微電極陣列能靈敏地檢測到藥物對細胞電生理信號的影響，并且傳感器具有穩定性，因此可發展成一個基于生物電生理信號分析的可靠的藥物毒性評估平臺，根據心肌細胞的電生理功能變化來對分析藥物毒性等。目前國內資料顯示人們已建立眾多房顫模型，如以犬等大型動物為代表的房顫模型，包括藥物房顫模型和電刺激模型。以中型動物兔為代表的房顫模型，如兔急性心房顫動模型，兔慢性心房顫動模型，離體兔心房顫動模型。其缺點是兔心房過小難以容納多折返環，不易模擬房顫的發生和維持。本實驗與之對應的微電極芯片評價電生理指標為場電位時程。實驗建立快速起搏右心房致房顫模型與臨床觀測的房顫具有一定共性，包含結構和功能兩方面的異常；模型能被誘導出房顫并能維持，房顫不會自行終止，而干預手段能有效終止。

理想的抗心律失常藥物應對誘發心律失常的多個靶點有作用；應對誘發心律失常的最佳靶點作用強調整動作電位時程恢復正常或略延長。通道蛋白水平分子的重構對房顫患者心房動作電位和有效不應期的縮短有重要意義，而多離子通道阻滯劑對心臟Na+、K+、Ca2+等多個離子通道有不同程度的調控作用，可使失調的離子通道功能恢復平衡，具有較低的致心律失常副作用[5,6]。有研究證實，房顫時心房有效不應期縮短除了與ICa，L、Ito、INa等電流減弱有關外，還與鉀離子通道基因表達及活性改變有關[7,8]。IK有三種類型：快速延遲整流鉀電流（IKr）、緩慢延遲整流鉀電流（IKs）和超快延遲整流鉀電流（IKur）。本實驗給予TEA作用右心耳組織致場電位時程延長。依據結果推測，IK 參與了房顫電重構中的鉀通道重構。給予BaCl2阻斷Kir，右心耳場電位時程延長。結果提示，快速起搏兔右心耳可能導致心房肌Kir減少，進而參與心房有效不應期（AERP）的縮短和房顫的維持，使用Kir特異性阻斷劑后，場電位時程延長，相應電重構的電生理指標心房有效不應期延長，阻止房顫的進一步發生。實驗給予CdCl2作用于心房組織，微電極芯片記錄中表現為場電位時程延長。以具有多離子通道阻滯效果的胺碘酮為代表的復合型Ⅲ類藥物成為近年來抗心律失常藥物研究的熱點。胺碘酮為多通道阻滯劑，對于包括鈉通道、L 型鈣通道以及鉀通道 IKr、IKs在內的多個心肌細胞膜離子通道均有阻滯作用[9]，可延長動作電位時程和有效不應期，延長心肌復極化時間。胺碘酮是目前唯一無逆頻率依賴性延長動作電位時程、心房有效不應期的藥物。在心肌細胞對開放和關閉狀態的IKs均有阻滯作用，但主要抑制開放狀態的IKs，這可能是其在快速心率時維持場電位時程延長作用的重要原因。本實驗給予胺碘酮顯示，右心耳場電位時程延長?？剐穆墒СＫ幬锖Y選評價指標包括動作電位時程延長，鉀、鈉、鈣電流的減少。本實驗中微電極芯片記錄指標場電位時程與動作電位時程均可客觀評價生理、病理狀態下心臟組織電生理改變和反映離子電流的變化。目前國內外文獻尚未報道有關應用微電極芯片技術測量病理狀態下和病理模型后心房組織場電位時程的可靠、真實的實驗數據。本實驗應用微電極芯片技術在接近房顫病理條件下，給予鈣和鉀通道阻斷劑記錄其對場電位時程變化的影響。通過區分藥物對不同觀測指標的作用及影響程度可直接判斷在抗房顫藥物中的分類。根據藥物對場電位時程的作用，可初步預測到該藥抗房顫可能存在的不良反應。由于各離子通道在不同病理進程中的變化并不是同步的，故以怎樣的程度和比例阻斷不同的離子通道才能成為理想的抗心律失常藥。

多離子通道阻滯劑是人們研究Ⅲ類抗心律失常藥物時提出的。臨床上，Ⅲ類抗心律失常藥物的致心律失常作用具有明顯差異。隨著臨床研究復雜性的增加， 臨床信息和基礎藥物研究之間鴻溝也在不斷加深，轉化醫學作為致力于克服這種困難的新型研究模式，加快候選藥物從實驗室走向臨床研究的步伐。隨著人們對抗心律失常藥物致心律失常機制的不斷深入認識，新的抗心律失常藥物概念的提出，以及更加完善的藥物安全評價指標的發現，人們會找到更加安全、有效的抗心律失常藥物。

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Evaluation of Anti-atrial Fibrillation Drug With Multi Ion Channel Targets by Micro-electrode Chip Technology in Experimental Rabbit Model

SUN Juan, HUANG Yan, ZHANG Ling, MA Mei,GUO Xin-gui, JIAO Chang-an, GUO Yu-jun, LIU Hai-li, LI Tianduo, XU Wen-li, MA Yi-tong.
Department Cardiology, Xinjiang Medical University, Urumqi (830011), Xinjiang, China

MA Yi-tong, Email: myt-xj@163.com

Objective: To evaluate and screen the anti-atrial fi brillation drug with multiion channel targets by micro-electrode chip technology in a rapid atrial pacing (RAP) rabbit model.Methods: A total of 32 rabbits were randomly divided into 4 groups, n=8 in each group. Potassium channel blocker (TEA) group, Potassium channel blocker (BaCl2) group, Potassium channel blocker (CdCl2) group and Amiodarone group.The electrode was inserted into right atrium via internal jugular vein with rapid right atrial pacing (600 beat/min) and the effect of each anti-atrial fi brillation drug on fi eld action potential (fAPD) were measured in different groups.Results: With 24 hour RAP, the fAPD was prolonged from (176.67 ± 8.66) ms to (196.11 ± 10.76) ms, P=0.012 in TEA group; from (182.22 ± 12.87) ms to (191.11 ± 13.09) ms, P=0.039 in BaCl2group; from (178.33±7.85) ms to (206.67 ± 9.70) ms, P=0.0015 in CdCl2group; from (167.38 ± 13.67) ms to (185 ± 15.14) ms, P=0.002 in Amiodarone group.Conclusion: RAP induced atrial fibrillation in experimental rabbit model is a simple and feasible method for screening the anti-atrial fibrillation drugs, combining with micro-electrode chip technology, it might be used for developing the new product.

Atrial rapid pacing; Micro-electrode chip; Field action potential duration; Amiodarone

2013-08-28）

（編輯：汪碧蓉）

新疆維吾爾自治區科技支疆項目（2013911119）

830011 新疆維吾爾自治區烏魯木齊市，新疆醫科大學第一附屬醫院 臨床博士后流動站（孫娟），心臟中心（張玲、馬嵋、郭玉君、劉海利、馬依彤） ；復旦大學附屬華東醫院（黃焰、郭新貴、焦昌安、李天奇、徐文莉）

孫娟 主治醫師 博士 研究方向：心臟電生理 Email: sunjuandee@126.com 通訊作者：馬依彤 Email: myt-xj@163.com

R445.1

A

1000-3614（ 2014） 08-0639-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.08.020

方法：兔32只隨機分為4組：鉀離子通道阻斷劑 Tetraethylammonium組（TEA組，n=8），鉀離子通道阻斷劑氯化鋇組（BaCl2組，n=8），鉀離子通道阻斷劑氯化鎘組（CdCl2組，n =8），胺碘酮組（n=8）。經頸內靜脈將電極置入右心房，以600次/分行心房快速起搏（RAP），給予TEA、BaCl2、CdCl2和胺碘酮觀察抗房顫藥物作用的離子通道對電生理指標場電位時程（fAPD）的影響。

結果： 24小時快速起搏后，20 mmol/L TEA 使場電位時程由（176.67±8.66）ms延長到（196.11±10.76） ms（P=0.012）。1×10-4mol/L BaCl2使 場電位時程由（182.22±12.87）ms延長到（191.11±13.09）ms（P=0.039）。CdCl2使場電位時程由（178.33±7.85）ms延長到（206.67±9.70）ms（P=0.0015）。2×10-6mmol/L 胺碘酮灌流心臟組織， 場電位時程由（167.38±13.67）ms延長到（185±15.14）ms（P=0.002），差異有統計學意義。

結論：快速起搏兔右心房致房顫模型是一種簡單可行的抗房顫藥物篩選模型，結合微電極芯片技術有可能用于抗房顫藥物開發的早期快速篩選。